基于活性成分筛选及近红外快检技术的车前草含量研究_刘晓凤.pdf

第 卷 第 期 年 月 成都大学学报（自然科学版）（）文章编号：（）：收稿日期：基金项目：新药中试四川省重点实验室开放课题（）；四川省中医药文化传承与研究中心 年度科研项目（）；德阳市科技局计划资助 年度科研项目（）；广西壮瑶药重点实验室 年开放课题（）；四川省科技成果转移转化示范项目（）作者简介：刘晓凤（），女，硕士，讲师，从事中药活性成分的提取研究：基于活性成分筛选及近红外快检技术的车前草含量研究刘晓凤，杨 放，梁 洪，熊 毅，梁 晴，袁宁谣，叶 萌（民办四川天一学院，四川 德阳；成都天河中西医科技保育有限公司，四川 成都；成都大学 药学院，四川 成都）摘 要：利用网络药理学筛选车前草的有效活性成分，采取高效液相色谱法建立指标性成分大车前苷含量测定的方法，将含量作为参比，借助偏最小二乘回归算法建立车前草大车前苷的定量校正模型，并对未知样品中大车前苷含量进行预测 结果显示，网络药理学筛选出排名靠前的活性成分有木犀草素、黄芩素、大车前苷、羟基木犀草素和高车前素 近红外检测的大车前苷定标标准偏差、相对分析误差、交叉检验标准误差、校正模型的决定系数、交叉验证相对分析误差和相关系数分别为 、.、和 本研究建立的模型检测速度快、效率高、结果可靠，可用于车前草大车前苷的质量控制关键词：车前草；网络药理学；含量测定；近红外快检技术；定量模型中图分类号：文献标志码：引 言 车前草为车前科植物车前（）或平车前（）的干燥全草，具有利尿通淋、抗菌抗炎、凉血解毒及清热明目的功效 中华人民共和国药典（以下简称中国药典）年版规定车前草的指标性成分为大车前苷，但其是否是车前草的有效成分还需要进一步研究网络药理学是从系统生物学的角度阐述中药成分与疾病靶点之间关系的学科，其可阐明中药的有效活性成分及治疗疾病的作用机制，广泛用于多种疾病、药理及毒理的机制研究，对临床合理用药、发展创新药物及发现新的适应证等可提供数据支撑中药具有多成分、多靶标和多通路的特点，其并不是通过单一成分预防或治疗疾病，而是通过多成分共同调节发挥作用 故采用网络药理学对车前草进行有效活性成分筛选可进一步为研究车前草的有效活性成分、质量控制指标及药理作用机制提供理论依据 车前草作为常用中药，其应用广泛 市场上的清宁丸、止泻灵片、复方枇杷叶膏和广东神曲等中成药处方中均含有车前草 由于市场需求较大，药材流通市场上个别原料供应商常通过掺伪或以次充好，导致药品质量参差不齐，故对车前草进行快速检测具有重要意义近红外光谱（）法是光谱衡量技术法和化学计量学技术法有效结合的二级分析法，已广泛应用于中草药及其产品分析中，相较传统分析方法而言，其具有快速、高效和无污染等优点 相关研究人员利用 技术对川贝母及其掺伪品进行了快速鉴别及掺伪量快速检测，建立了三七的质量快速评价体系等 本研究以网络药理学技术为手段，中国药典 年版为基准，采用 法对车前草制定快速检测的方法，高效完成车前草质量分级，增加栽培、采收、加工与销售等各环节的质量把控，以期为车前草质量控制提供参考 材 料 仪 器 型近红外光谱分析仪（北京伟创英图科技有限公司），型快速水分测定仪（上海精科实业有限公司），型超纯水仪（成都品成科技有限公司），型电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司），型超声波清洗器（深圳得康洗净电器有限公司），型高效液相色谱仪（日本岛津公司），型万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）材 料大车前苷对照品（批号，），成都科隆化学 品 有 限 公 司；批 车 前 草 原 药 材（批 号，），均采自四川省德阳市，经成都大学郭晓恒副教授鉴定为车前科植物车前（）的干燥全草；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯 方法与结果 网络药理学法 “成分靶点通路”网络的构建采用中药系统药理学网络数据库和分析软件、中药分子机制生物信息学分析工具，以及中国天然产物化学成分数据库，检索获得车前草有效活性成分中“化合物靶点通路”相互作用 网络，得到 个节点（个化合物节点与 个靶点节点）及 个基因对应通路 该网络中，每个化合物平均与 个靶点相互作用，每个靶点平均与 个疾病通路有关 因此，车前草中存在单化合物与多靶点的作用，同时也存在多化合物作用于单靶点的现象 功能富集分析通过网络数据库进行 功能富集分析研究，共得到 个 条目（），分别对应生物过程（）、细胞组成（）和分子功能（）各 个条目，如图 所示 通路富集分析 同时利用网络数据库进行 通路富集分条目条目条目010 20 30 40 50数目（A）BP 功能分析结果柱状图010 15 20 25 30 35数目（B）CC 功能分析结果柱状图5010 20 30 40 50数目（C）MF 功能分析结果柱状图细胞蛋白质代谢过程的正调控对脂质的反应对激素的反应细胞对含氧化合物的反应细胞群增殖的正调控程序性细胞凋亡的正调控细胞死亡的负调控蛋白质代谢过程的负调控细胞凋亡过程的调控对细胞因子的反应对内生刺激的反应程序性细胞凋亡的调控对有机氮化合物的反应细胞群增殖的调控对含氧化合物的反应对有机环状化合物的反应对化学物质的反应细胞对化学刺激的反应细胞对有机物的反应对有机物的反应核膜转录调节复合体染色体核染色体细胞外区核腔细胞外间隙核核外壳胞质溶胶宿主细胞核核质细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶转移酶复合物，转移含磷基团细胞质核周区全膜细胞器内腔蛋白激酶复合物含蛋白质复合物膜筏酶调节剂活性细胞周期蛋白依赖性蛋白丝/苏氨酸分子功能调节剂蛋白磷酸酶结合泛素蛋白连接酶结合催化活性，作用于蛋白质磷酸酶结合蛋白激酶活性蛋白质同源二聚活性含蛋白复合物结合泛素样蛋白连接酶结合结合蛋白激酶结合蛋白质二聚化活性激酶结合蛋白结构域特异性结合信号受体结合蛋白质结合酶结合相同蛋白质结合图 车前草的成分作用靶点 功能分析图析，共获得前列腺癌、小细胞肺癌、膀胱癌与非小细成都大学学报（自然科学版）第 卷 胞肺癌等 条信号通路（.）其中，前列腺癌通路涉及、和 等基因；膀胱癌通路涉及、和 等基因；小 细 胞 肺 癌 通 路 涉 及、和 等 基 因；非 小 细 胞 肺 癌 涉 及、和 等基因 选 值较小的前 个通路进行可视化，结果如图 所示基因数量1015202530P 值2.0e-091.5e-091.0e-095.0e-100 0.1 0.2 0.3富集因数癌症通路前列腺癌乙肝病毒携带者膀胱癌胰腺癌慢性粒细胞白血病T 细胞受体信号通路TNF 信号通路HTLV-I 感染小细胞肺癌黑色素瘤癌症中的蛋白多糖PI3K-Akt 信号通路非小细胞肺癌凋亡神经胶质瘤HIF-1 信号通路麻疹FoxO 信号通路恰加斯病（美洲锥虫病）通路图 车前草作用靶点 通路富集分析的 条通路气泡图 有效成分筛选 通过分析“化合物靶点”的中心度值、亲中心度值及等级值等，筛选出排名前 位的化合物依次为木犀草素、黄芩素、大车前苷、羟基木犀草素和高车前素，分别能与、和 个靶点蛋白发生作用 从靶点的角度分析，排名前 的靶点为、和，分别能与、和 个疾病通路作用 上述网络药理学筛选结果表明，中药是多成分与多靶点共同发挥作用的，而有效成分的含量直接影响中药的质量 通过网络药理学研究可以从整体上对车前草成分进行理论筛选，为后续含量研究提供参考 网络药理学研究结果验证了中国药典 年版规定车前草的指标性成分为大车前苷具有合理性，可通过对车前草中大车前苷的含量对其质量进行控制 法采用高效液相色谱（）法建立车前草中的指标性成分大车前苷含量测定的方法，将含量作为参比，借助偏最小二乘回归算法建立车前草中大车前苷的定量校正模型，并对未知样品中大车前苷含量进行预测 色谱条件色谱柱为 柱（，）；以乙腈 甲酸溶液（）为流动相；检测波长为；流速为 ；柱温为；进样量为 理论板数按大车前苷峰计算应不低于 对照品溶液制备取大车前苷对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加 甲醇制成每 含 的对照品溶液，备用 供试品溶液制备将车前草样品干燥后，粉碎过 号筛，取样品粉末约 ，精密称定，置于 锥形瓶中，加入甲醇 ，称定质量，超声处理（温度 ，频率 ，功率 ），放冷，再次称定质量，用 甲醇补足减失的质量，摇匀，过 微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液 方法学考察）系统适用性试验 精密吸取“”项下对照品溶液与“”项下供试品溶液各 ，按照“”项下色谱条件进行测定 结果表明，供试品溶液与对照品溶液的保留时间一致，分离度均大于）本研究已经进行线性、仪器精密度、稳定性、重复性和加样回收试验，结果均符合相关要求 样品测定按照“”项下制备 批车前草供试品溶液，精密吸取 ，按照“”项下色谱条件进行测定，图谱如图 和图 所示，结果见表 1501201007550250信号/mV01.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0t/min图 大车前苷对照品 图谱 第 期 刘晓凤，等：基于活性成分筛选及近红外快检技术的车前草含量研究信号/mV01.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.01501401301201101009080706050403020100-10t/min图 车前草供试品 图谱表 批车前草样品含量测定结果批号含量 批号含量 将采用 法测得的含量作为参比，借助偏最小二乘回归算法建立车前草中大车前苷的定量校正模型，并对未知样品中大车前苷含量进行预测 车前草 模型的建立从 批车前草样品中随机选取、和 共 批车前草样品作为验证集样 余下 批次车前草作为校正集样 车前草 图谱采集将 分析仪开机预热 ，将 批车前草粉末样品（过 号筛）放入样品袋中，压实样品直至不松动，再把样品袋对准垂直的仪器进行测定 仪器基线噪声值 ，光源能量值 ，基线重复性值 ，波长准确性值 ，波长重复性值 ，吸光度重复值 ，测量模式均为正常 光谱扫描时，参比为仪器内置背景，扫描次数 次，分辨率值为 ，扫描范围为 批车前草样品 原始叠加图谱如图 所示3.02.52.01.51.00.5吸光度/Abs9009501 0001 0501 1001 1501 2001 2501 3001 3501 4001 4501 5001 5501 6001 6501 7001 7501 800波数/cm-1图 批车前草样品 原始叠加图谱 光谱预处理光谱预处理应选择最适合的方法，这样不仅能除去噪声的干扰，还能减少杂光、散光及样品物理状态等因素对模型准确性的影响 本研究所用的化学计量学分析软件 具有多种光谱预处理的方法，例如，消除常数偏移量、矢量归一化和一阶导数等 本研究对叠加光谱图进行了前处理和波段选择，消除了噪声比较大的波段，结果如图 所示吸光度/Abs波数/cm-10.0020.0010-0.0011 0001 1001 2001 3001 4001 5001 6001 700图 批车前草样品 精简图谱 校正模型的建立利用化学计量学分析软件 的优化功能完成模型的构造，做完内部交叉检验，从而确定一定参数作为指标性参考，包括系数、内部交叉验证均方差和相对分析误差等，获得车前草中大车前苷最优的校正模型 本研究把 份校正集车前草样品的 图谱和 法测定值运用偏最小二乘回归算法拟合，使用留一法进行内部交互验证，从而达到模成都大学学报（自然科学版）第 卷 型验证，得到模型的主因子数，确定车前草中大车前苷含量的定量模型，将含量预测值与真实值进行比较 结果如图 所示预测数据1.41.21.00.80.60.40.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5参考数据图 车前草中大车前苷定量模型校正曲线 初步建立的车前草中大车前苷定量校正模型方程式为 .，表明模型准确性高 采用交叉验证标准误差和相关系数等相关数据对模型的优缺点进行客观评价 其中，定标标准偏差、相对分析误差、交叉检验标准误差、校正模型的决定系数、交叉验证相对分析误差和相关系数分别为 、和 模型验证取验证集样品 批，利用已建立的定量模型进行外部交叉验证，如图 所示预测数据-25-20-15-10参考数据0-5-10-15-20-25-50图 车前草大车前苷定量模型外部验证结果 获得预测的结果方程式为 .，结果证明预测值与参考值相关性接近，所建定量模型稳定可靠，可用于车前草样品中大车前苷含量的快速检测，具体结果见表 表 车前草大车前苷 含量和 预测含量值对比批号 含量 预测含量 差值 差值平均值 讨 论目前，多数中药有效成分不明，作用机制不清，其现行质量标准中测定的成分不能确定是指标性成分还是有效成分，这为中药质量控制带来了一定的难度 现代研究指出，中药及其复方制剂具有多成分、多靶点与多通路的特点，多个成分共同协调发挥药效作用 本研究通过网络药理学对车前草的成分和相关通路进行分析，筛选出排名靠前的 种成分中包括中国药典 年版中规定车前草的指标性成分大车前苷，从而验证了该指标测定的必要性与重要性本研究建立的 快检技术，能够快速、准确地进行现场质量评价，样品处理操作简单，在不耗损样品的情况下可对车前草中大车前苷进行高效率、精准和稳定地测定 在车前草成熟期采收及销售现场即可满足产品等级的划分，可以减少质量把关不足的缺点，同时减少检测时间，提高工作效率本研究建立了车前草中大车前苷快速检测模型，用已建立的定量模型进行外部交叉验证，预测的结果与中国药典 年版中的方法测定值较为接近 快速测定为间接分析法，其准确性与大量有代表性的样品的数量密切相关，因此为了确保测定的准确性及稳定性，应该要提高各地区的样本数量，对不同产地与不同阶段的车前草应重新建立对应的模型参考文献：陈启鑫 中药车前草的研究进展 中西医结合心血管病电子杂志，（）：国家药典委员会 中华人民共和国药典 北京：中国医药科技出版社，孙浪 基于网络药理学的痛风定胶囊治疗痛风及高尿酸血症的作用机制研究 大理：大理大学，胡子毅，张平，李人亮，等 基于网络药理学探讨消痛汤治疗痛风的作用机制 亚太传统医药，（）：刘浪，莫易，朱蠡庆，等 车前草治疗隐匿性肾炎的网络药理学机制 武汉工程大学学报，（）：张贵彪，陈启龙，苏式兵 中药网络药理学研究进展 第 期 刘晓凤，等：基于活性成分筛选及近红外快检技术的车前草含量研究中国中医药信息杂志，（）：王琪，陶河清 车前草药理作用的研究进展 世界最新医学信息文摘，（）：王歌 车前草化学成分与药理作用的研究 黑龙江医药，（）：张雪芹，曲玮，梁敬钰 车前草化学成分和药理作用研究进展 海峡药学，（）：蒙杰丹 近红外光谱法快速无损分析测定中药活性成分的研究 重庆：西南大学，陈颖，王璐，尚宏鑫，等 近红外光谱技术在水产养殖行业的应用进展 河北渔业，（）：杨帆 近红外光谱法在汽柴油分析检测中的应用中国石油和化工标准与质量，（）：胡杨，李先芝，刘洋，等 近红外光谱技术在中药质量监控中的研究进展 安徽农业科学，（）：范林宏，何林，谭超群，等 基于便携式近红外光谱技术快速检测川贝母掺伪问题 中国实验方剂学杂志，（）：周婷，付绍兵，谢慧敏，等 近红外光谱在川贝母及非川贝母品种鉴别中的应用 华西药学杂志，（）：周雨枫 近红外光谱法应用于三七质量评价 天津：天津医科大学，李海英，潘雪，王敏存，等 基于超分子“气析”理论定量整合与验证中药成分及靶点群 中国实验方剂学杂志，（）：王升启 中药作用分子机制研究新策略 中国药理学与毒理学杂志，（）：（责任编辑：伍利华），（，；，；，）：，：；成都大学学报（自然科学版）第 卷