硫化氢光声探针的设计及其构效关系_董雪梅.pdf

第 39 卷第 1 期 化学反应工程与工艺 Vol 39,No 1 2023 年2 月 Chemical Reaction Engineering and Technology Feb.2023 收稿日期收稿日期：2022-05-13；修订日期修订日期：2023-01-10。作者简介作者简介：董雪梅（1997），女，博士；赵春常（1976），男，教授，通讯联系人。E-mail:。基金项目基金项目：国家自然科学基金（21874043）。文章编号：文章编号：10017631(2023)01005309 DOI:10.11730/j.issn.1001-7631.2023.01.0053.09 硫化氢光声探针的设计硫化氢光声探针的设计及及其构效关系其构效关系 董雪梅，朱 凝，王荣晨，赵春常 华东理工大学化学与分子工程学院，精细化工研究所，上海 200237 摘要：摘要：分子探针的光谱性质与其本身的化学结构紧密相关，研究分子结构与光谱性能之间的关系对于理性设计性能优异的分子探针具有重要的指导意义。本工作以不对称氯代氟硼二吡咯染料为母体，通过 Knoevenagel反应引入了以喹啉盐为母体结构的吸电子基团，仅改变同一位置的不同取代基，分别设计合成了四个硫化氢分子探针（BOD-NO2，BOD-H，BOD-BOC 和 BOD-NH2），并对取代基变化产生的性能差异进行了系统的探究。结果表明：由于不同喹啉盐取代基电子效应的变化，影响了其吸电子能力，从而引起探针与硫化氢反应性能的变化。这四个探针均能特异性检测硫化氢，而且随着取代基吸电子能力的增强，探针与硫化氢发生亲核取代反应的速率及程度增大，吸收光谱红移量增加，光声成像效果更加优异。通过对探针构效关系的研究，成功筛选出性能优良的光声探针 BOD-NO2，该探针能与硫化氢特异性响应，且响应速度快，选择性高，具有体内光声成像的应用潜力。本研究为硫化氢光声探针的设计提供了一种思路。关键词：关键词：硫化氢硫化氢 氯代氯代氟硼二吡咯氟硼二吡咯 分子分子探针探针 构效构效关系关系 中图分类号：中图分类号：O643.38 文献标识码：文献标识码：A 光声（PA）成像作为一种新兴的非侵入性成像模式将光学激发和声学检测相结合，是基于“光进声出”原理的成像技术1-3，即利用近红外纳秒脉冲激光照射造影剂，光子被吸收后通过热弹性膨胀产生声波，然后对声波进行检测和处理以输出图像4。由于超声信号在生物组织中的散射较低，因此光声成像具有较高的组织穿透深度5-7。当前，相较于纳米复合材料在光声成像研究中的应用，基于有机小分子染料发展的 PA 探针由于操作简单、可重复性好等优势也受到了广泛的关注8-9。硫化氢气体分子是继一氧化碳、一氧化氮被公认的第三种气体信号分子10，参与许多的生理和病理过程，发挥重要的调节作用，如调节血管舒张、神经传导、心肌收缩、细胞凋亡、炎症及胰岛素分泌等11-15，而且内源性硫化氢水平的异常与许多癌症的发生发展密切相关，因此发展具有高选择性且长期稳定的硫化氢分析方法，对于准确获取生物组织生理病理过程的动力学信息，以及精准区分复杂的肿瘤细胞机制具有重要的研究意义16。分子探针的光谱性质与其本身的化学结构息息相关。不同取代基的修饰对化合物分子的光物理性能具有很大的影响，利用不同取代基对生色团分子所产生的电子效应，可以有效调节 PA 探针分子的吸收和发光性能，从而获取高光子吸收和最小辐射衰减（量子产率）以提高探针的光声性能17-20，因此，研究分子结构与光谱性能之间的关系对指导合成和修饰各种光声性能优越的化合物具有重大意义。54 化学反应工程与工艺 2023年2月 氟硼二吡咯（BODIPY）作为常见的小分子有机染料，可用于构建检测内源性硫化氢的 PA 探 针21-22。本工作以不对称氯代氟硼二吡咯（BOD-CHO）染料中的氯元素作为硫化氢的反应位点，通过 Knoevenagel 反应，在同一位置引入四个以喹啉盐作为母体结构的不同吸电子基团，构建了四个硫化氢分子探针 BOD-NO2，BOD-H，BOD-BOC 和 BOD-NH2，研究了探针的构效关系，筛选出性能优良的光声探针。1 实验部分实验部分 1.1 分子探针分子探针的合成的合成 目标产物合成所涉及的化学药品以及溶剂均为分析纯级。所需要的干燥溶剂均为超干溶剂，层析分离液采用二氯甲烷（DCM）与甲醇（MeOH）体积比（DCM:MeOH）为(1020):1 的混合液。合成反应式如下：（1）1.1.1 BOD-NO2的合成 将 BOD-CHO23（50 mg，0.13 mmol）和化合物 N-NO2（64 mg，0.19 mmol）溶于适量无水乙醇，加入 50 L 三氟乙酸后 90 回流反应 1.5 h。减压蒸馏除去溶剂，经柱层析分离（DCM:MeOH=15:1）得黑色固体 20 mg，产率为 22%。为了确定产物的结构，通过核磁共振氢谱（1H NMR）和高分辨质谱（HRMS）对化合物进行了表征，表征结果充分确定了目标产物的结构。产物1H NMR 400 MHz，氘代甲醇（CD3OD）：9.13（d，J=4 Hz，1H），8.94（d，J=8 Hz，1H），8.79（m，1H），8.58（m，2H），8.07（d，J=16 Hz，1H），7.63（m，3H），7.59（d，J=16 Hz，1H），7.49（m，2H），7.01（s，1H），4.48（s，3H），2.65（s，3H），2.45（m，2H），1.53（s，3H），1.07（t，J=8 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，CD3OD）：168.36，161.31，158.77，143.43，139.16，139.06，138.70，137.31，135.15，133.84，131.95，128.17，124.82，119.95，115.32，38.62，28.70，21.69，15.87，12.10。HRMS（ESI，m/z）：calculated for C31H27BClF2N4O2 M-I+571.188 4，found 571.189 4。1.1.2 BOD-H 的合成 将 BOD-CHO（50 mg，0.13 mmol）和化合物 N-H（73.56 mg，0.26 mmol）溶于适量甲苯，加入80 L 乙酸 120 加热回流 4 h。冷却，水洗，DCM 萃取，无水 Na2SO4干燥，过滤，减压蒸馏除去DCM，经柱层析提纯（DCM:MeOH=20:1）得到黑色固体 25 mg，产率为 30%。通过 NMR 和 HRMS对化合物进行了表征，确定了产物的结构。产物1H NMR 400 MHz，氘代二甲基亚砜（d6-DMSO）：8.97（d，J=8 Hz，1H），8.55（d，J=8 Hz，1H），8.49（d，J=8 Hz，1H），8.33（d，J=8 Hz，1H），8.16（m，1H），7.93（t，J=8 Hz，1H），7.85（d，J=16 Hz，1H），7.66（m，4H），7.53（m，2H），7.11（s，1H），4.43（s，3H），2.65第39 卷第1 期 董雪梅等.硫化氢光声探针的设计及其构效关系 55（s，3H），2.42（m，2H），1.43（s，3H），1.10（t，J=6 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，d6-DMSO）：167.55，155.87，143.62，138.97，133.26，127.48，124.15，124.06，122.97，121.06，120.93，119.04，118.08，34.12，30.98，29.67，16.32，13.54。HRMS（ESI，m/z）：calculated for C31H28BClF2N3 M-I+525.206 9，found 525.206 8。1.1.3 BOD-BOC 的合成 将 BOD-CHO（50 mg，0.13 mmol）和化合物 N-BOC（103 mg，0.26 mmol）溶于 10 mL 甲苯中，向其中加入 74 L 乙酸，120 加热回流 4 h。冷却至室温，水洗，DCM 萃取，无水 Na2SO4干燥，过滤，减压蒸馏除去 DCM，经柱层析纯化（DCM:MeOH=15:1）得到黑色固体 30 mg，产率为 30%。采用 NMR 和 HRMS 对合成化合物进行了表征，表征结果充分确定了目标产物的结构。产物1H NMR（400 MHz，d6-DMSO）：10.17（s，1H），8.89（d，J=8 Hz，1H），8.45（m，3H），7.99（dd，1H），7.73（d，J=16 Hz，1H），7.65（m，3H），7.54（m，2H），7.39（m，1H），7.07（s，1H），4.38（s，3H），2.64（s，3H），2.41（m，2H），1.53（s，9H），1.42（s，3H），1.00（t，J=8 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，d6-DMSO）：167.30，153.40，152.46，146.94，146.83，139.59，134.46，128.73，126.43，124.05，120.97，118.00，114.07，80.18，30.98，29.67，28.83，27.85，21.90，16.32，13.54。HRMS（ESI，m/z）：calculated for C36H37BClF2N4O2 M-I+641.266 6，found 641.267 2。1.1.4 BOD-NH2的合成 将 BOD-CHO（50 mg，0.13 mmol）和化合物 N-BOC（103 mg，0.26 mmol）溶于适量甲苯，加入 45 mg 对甲苯磺酸 120 加热回流 4 h。冷却至室温，水洗，DCM 萃取，无水 Na2SO4干燥，过滤，减压蒸馏除去 DCM，利用柱层析纯化（DCM:MeOH=10:1）得到黑色固体 20 mg，产率为 23%。采用NMR 和 HRMS 对化合物进行了表征，确定了目标产物的结构。产物1H NMR（400 MHz，d6-DMSO）：8.55（d，J=8 Hz，1H），8.21（m，2H），7.63（m，3H），7.57（d，J=2.4 Hz，2H），7.53（m，2H），7.46（m，1H），7.06（d，J=2.4 Hz，1H），7.02（s，1H），4.32（s，3H），2.64（s，3H），2.41（m，2H），1.42（s，3H），1.00（t，J=8 Hz，3H）。13C NMR（100 MHz，d6-DMSO）：166.90，149.14，143.38，138.20，132.02，130.12，128.72，123.17，120.46，120.03，118.40，105.98，30.98，29.67，28.83，16.31，13.57，11.95。HRMS（ESI，m/z）：calculated for C31H29BClF2N4 M-I+541.214 2，found 541.214 7。1.2 BOD-R 探针的表征探针的表征以及对以及对硫化氢硫化氢响应性能测试响应性能测试 BOD-R 探针的核磁共振谱图采用 Bruker AV-400 核磁共振波谱仪测定；高分辨质谱采用 Waters LCT Premier 质谱仪测定。探针与硫化氢响应的光学测试、探针的特异性响应以及探针的 pH 效应测试都是采用 Varian Cary 50 紫外分光光度计表征。将 BOD-R 探针溶解在二甲基亚砜（DMSO）中配置成浓度为 10 mmol/L 的浓溶液，移取 3 L 探针浓溶液（10 mmol/L）加入装有 3 mL 缓冲液（乙腈与磷酸缓冲盐溶液的体积比为 1:1，pH 值为 7.4）的比色皿中，使得探针的最终浓度为 10 mol/L，再移取 3 L 浓度为 100 mmol/L的 NaHS 溶液加入上述比色皿中，NaHS 的最终浓度为 100 mol/L。将比色皿放入恒温摇床中（37，频率为 120 次/min），测定 37 下 BOD-R 探针与 NaHS 响应的紫外吸收光谱随时间变化。56 化学反应工程与工艺 2023年2月 BOD-R探针与硫化氢响应的光声成像性能采用德国iTheraMedical MSOT 128光声成像系统测定。在装有 3 mL 缓冲液的比色皿中加入 24 L 的 BOD-R 探针浓溶液（10 mmol/L），得探针的最终浓度为80 mol/L，再移取 3 L 的 NaHS 溶液（100 mmol/L）加入上述比色皿中，在 37 下进行反应。同时测定其吸收光谱。780 nm 激发下，测试了探针在有无 NaHS 存在条件下的光声信号。2 结果与讨论结果与讨论 2.1 四种探针四种探针与与硫化氢硫化氢响应的光响应的光学学性能性能 首先测定了四种探针在缓冲液中与硫化氢响应的吸收光谱变化，结果如图 1 所示。由图 1 可见，四种探针对应540 nm左右的吸收强度随时间的增加而下降，同时在780 nm左右出现一个新的吸收峰，且峰强度随着时间的增加而显著升高，表明了硫化氢可以有效触发探针的光谱变化。另外，BOD-NO2，BOD-H，BOD-BOC，BOD-NH2探针与 NaHS 响应的吸收光谱变化分别在 30，150，120 和 180 min时趋于平稳。由此可知，由于电子受体喹啉盐的取代基的吸电子能力依次减弱（NO2，H，BOC，NH2），使得喹啉盐基团的吸电子能力依次减弱，进而使探针与硫化氢的亲核取代反应速率及程度依次减弱。同时也表明了利用取代基电子效应的变化可以有效调控探针与硫化氢的响应性能及光谱变化，从而获得理想的硫化氢探针。5006007008009001000(a)BOD-NO2 Wavelength/nmT/min 0 0.5 1 2 3 5 10 15 20 30 500600700800900(b)BOD-H Wavelength/nmT/min 0 3 10 20 30 45 60 90 120 150 500600700800900(c)BOD-BOC Wavelength/nmT/min 0 5 10 20 30 45 60 75 90 120 500600700800900(d)BOD-NH2 Wavelength/nmT/min 0 5 15 30 45 60 90 120 150 180 图 1 BOD-R（10 mol/L）与硫化氢（100 mol/L）在 CH3CN/PBS 体系中的吸收光谱响应 Fig.1 Absorption spectral responses of BOD-R(10 mol/L)and H2S(100 mol/L)in CH3CN/PBS 2.2 四种探针四种探针与与硫化氢硫化氢响应的机理响应的机理 探针与硫化氢作用的机理是利用硫化氢的强亲核能力与探针分子上氯原子进行芳香亲核取代反应，见式（2）。此外，具有不同取代基的喹啉基团通过亚乙烯连接基团与 BOD 母体连接，使氯原子与硫化氢更易发生芳香亲核取代反应，生成对应的硫醇产物，并产生相应的光学变化。探针与硫化氢第39 卷第1 期 董雪梅等.硫化氢光声探针的设计及其构效关系 57 之间的芳香亲核取代反应机理可通过图 2 所示的高分辨质谱的表征得到验证。（2）(a)(b)(c)58 化学反应工程与工艺 2023年2月 (d)图 2 探针与硫化氢反应机制的高分辨质谱表征 Fig.2 High-resolution mass spectrometry characterization of the reaction mechanism between the probe and H2S 2.3 四种探针四种探针的的特异性响应特异性响应 探针对分析物的特异性响应（即选择性）是衡量探针是否具有优良性质的重要指标。实验测试了常见干扰物质对硫化氢响应的影响，结果如图 3 所示。1 2 3 4 5 6 7 8 91011121314151617181920absorption at 778 nm(a)BOD-NO2 (1)free；(2)F-；(3)Cl-；(4)Br-；(5)I-；(6)N3-；(7)NO2-；(8)NO3-；(9)AcO-；(10)HCO3-；(11)HPO42-；(12)H2PO4-；(13)S2O42-；(14)S2O32-；(15)SO42-；(16)SO32-；(17)GSH；(18)Hcy；(19)Cys；(20)NaHS 1 2 3 4 5 6 7 8 91011121314151617181920absorption at 703 nm(b)BOD-H (1)free；(2)F-；(3)Cl-；(4)Br-；(5)I-；(6)N3-；(7)NO2-；(8)NO3-；(9)AcO-；(10)HCO3-；(11)HPO42-；(12)H2PO4-；(13)S2O42-；(14)S2O32-；(15)SO42-；(16)SO32-；(17)GSH；(18)Hcy；(19)Cys；(20)NaHS 1 2 3 4 5 6 7 8 91011121314151617181920absorption at 698 nm(c)BOD-BOC (1)free；(2)F-；(3)Cl-；(4)Br-；(5)I-；(6)N3-；(7)NO2-；(8)NO3-；(9)AcO-；(10)HCO3-；(11)HPO42-；(12)H2PO4-；(13)S2O42-；(14)S2O32-；(15)SO42-；(16)SO32-；(17)GSH；(18)Hcy；(19)Cys；(20)NaHS 1 2 3 4 5 6 7 8 91011121314151617181920absorption at 687 nm(d)BOD-NH2 (1)free；(2)F-；(3)Cl-；(4)Br-；(5)I-；(6)N3-；(7)NO2-；(8)NO3-；(9)AcO-；(10)HCO3-；(11)HPO42-；(12)H2PO4-；(13)S2O42-；(14)S2O32-；(15)SO42-；(16)SO32-；(17)GSH；(18)Hcy；(19)Cys；(20)NaHS 图 3 探针的选择性测试结果 Fig.3 Selectivity test results of probes 由图 3 可见，BOD-R 探针与多种物质充分反应后，仅与 NaHS 反应的吸收光谱发生了明显的变化，其他干扰物质（浓度为 1 mmol/L）存在时吸收光谱几乎不变，由此说明 BOD-NO2，BOD-H，BOD-BOC 和 BOD-NH2探针能够特异性识别硫化氢。2.4 四种探针四种探针的的 pH 效效应应 鉴于生物体内环境 pH 不同，测试了不同的 pH 环境下四种探针与硫化氢响应的吸收光谱变化，第39 卷第1 期 董雪梅等.硫化氢光声探针的设计及其构效关系 59 结果见图 4。56789pH valueabsorption at 778 nm(a)BOD-NO2 probe probe+H2S 56789 pH valueabsorption at 703 nm(b)BOD-H probe probe+H2S 56789 pH valueabsorption at 698 nm(c)BOD-BOC probe probe+H2S 56789 pH valueabsorption at 687 nm(d)BOD-NH2 probe probe+H2S 图 4 BOD-R（10 mol/L）在不同 pH 值下与与硫化氢（100 mol/L）的响应能力 Fig.4 Responsiveness of BOD-R(10 mol/L)to H2S(100 mol/L)at different pH values 由图 4 可以看出，环境 pH 对探针与硫化氢的反应程度有一定的影响。在酸性环境下，四个探针与硫化氢的反应程度都比碱性环境下反应程度低，四种探针均在 pH 值为 78 时反应程度较高，且在pH 值为 7.4 时反应程度最大。但不可否认的是，四种探针均能在不同 pH 环境下实现对硫化氢的检测，具有进一步生物应用的潜力。2.5 四种探针四种探针与与硫化氢硫化氢响应的光声测试响应的光声测试 四种探针与硫化氢响应的光声测试结果如图 5所示。由图 5 可知，当硫化氢不存在时，四种探针在缓冲液中均未产生可检测到的光声信号。当硫化氢加入缓冲液中，使探针与硫化氢反应完全后，即四种探针分别与硫化氢反应 30，150，120 和 180 min后，在 780 nm 激发下，探针均产生了光声信号，且BOD-NO2，BOD-H，BOD-BOC 和 BOD-NH2探针的光声信号强度（PA Intensity）依次减弱，再次验证了上述光谱测试的结论，即探针与硫化氢发生亲核取代反应的速率及程度与引入基团的吸电子能力有关，吸电子能力越强，探针与硫化氢发生亲核反应的速率及程度越大，吸收光谱的红移量增加，光声成像的效果更加优异。0.01.53.04.56.0BOD-NO2 BOD-H BOD-BOC BOD-NH2 PA intensity10-4 probes probes+H2S 图 5 BOD-R 与硫化氢响应的光声图像和信号强度 Fig.5 Photoacoustic images and amplitudes of BOD-R in the absence and presence of H2S 60 化学反应工程与工艺 2023年2月 3 结结 论论 本研究构建了四种硫化氢分子 BOD-NO2，BOD-H，BOD-BOC 和 BOD-NH2探针。四种探针均能特异性识别硫化氢，且在不同的 pH 环境下实现对硫化氢的检测。研究表明，探针的反应性能和成像效果可以利用取代基电子效应进行优化，即引入基团的吸电子能力越强，探针与硫化氢发生亲核取代反应的速率及程度越大，获取的光声信号越强。通过对探针构效关系的研究，成功筛选出 BOD-NO2探针是一个性能优良的硫化氢光声成像分子探针，展现出巨大的生物应用潜力。参考文献：参考文献：1 ABBASI S,LE M,SONIER B,et al.All-optical reflection-mode microscopic histology of unstained human tissuesJ.Scientific Reports,2019,9(1):13392.2 WANG L V,YAO J.A 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sulfide molecular probes(BOD-NO2,BOD-H,BOD-BOC and BOD-NH2)were designed and synthesized to investigate systematically the performance differences caused by the change of substituents.The results proved that the accompanying change of the different quinoline salt was the different electron withdrawing ability of probe,which leaded to the change of the reaction performance of the probe with H2S.These four probes showed specifical responsiveness to H2S.With the enhancement of the electron absorption ability of the substituents,the rate and extent of nucleophilic substitution reaction between the probes and H2S