大黄鱼内脏白点病病原拮抗菌的分离鉴定及生物学特性研究_李张婵.pdf

DOI:10.12131/20220251文章编号：2095 0780（2023）03 0078 10大黄鱼内脏白点病病原拮抗菌的分离鉴定及生物学特性研究李张婵1，施 慧2，许文军2，何 杰2，谢建军2，王庚申2，汪 玮21.浙江海洋大学 水产学院，浙江 舟山 3160222.浙江省海洋水产研究所/浙江省海水增养殖重点实验室，浙江 舟山 316021摘要：为实现大黄鱼(Larimichthys crocea)内脏白点病的生物防控，推进水产养殖用药减量，从健康大黄鱼肠道中筛选出对其内脏白点病病原菌杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicid)有拮抗作用的益生菌。采用琼脂扩散法筛选菌株，通过生理生化特征以及分子生物学分析，对菌株进行鉴定，并评价其溶血性、药敏性、安全性、产酶能力及抗菌广谱性。从健康大黄鱼肠道中初步分离出37株潜在益生菌，通过拮抗试验筛选出3株具有拮抗效果的菌株，分别命名为P1-17、P2-33和P3-11。通过生理生化特性及16S rRNA 测序分析，菌株P1-17和P2-33鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，菌株P3-11鉴定为粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；溶血性试验和药敏试验结果表明3株菌均无显著溶血圈，且所含耐药因子较少，不具备潜在致病性；人工回感试验证实，3株拮抗菌对健康大黄鱼无致病性；抗菌谱测定结果表明，2株芽孢杆菌对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)等多种水产病原菌具有拮抗效果，同时2株芽孢杆菌具有产淀粉酶和蛋白酶的能力；而该株粪肠球菌只对杀香鱼假单胞菌有拮抗作用。研究结果可为后续大黄鱼肠道益生菌的筛选和应用提供科学依据。关键词：大黄鱼；杀香鱼假单胞菌；拮抗菌；贝莱斯芽孢杆菌；粪肠球菌中图分类号：S 942.3文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Screening of antagonistic bacteria against visceral white-spots disease ofLarimichthys crocea and preliminary study on its biological characteristicsLI Zhangchan1,SHI Hui2,XU Wenjun2,HE Jie2,XIE Jianjun2,WANG Gengshen2,WANG Wei21.School of Fishery,Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China2.Zhejiang Marine Fisheries Research Institute/Zhejiang Province Key Laboratory of Mariculture and Enhancement,Zhoushan 316021,ChinaAbstract:In order to achieve the biological prevention and control of visceral white-spots disease of Larimichthys crocea,andpromote the reduction of drug use in aquaculture,we isolated and screened the probiotics with an antagonistic effect on Pseudo-monas plecoglossicid,which is a pathogen of visceral white spot disease in L.crocea,from the intestine of healthy L.crocea.Thestrains were screened by agar diffusion method,identified by physiological and biochemical characteristics and molecular bio-logy analysis,and evaluated for hemolysis,drug sensitivity,safety,enzyme production ability and broad-spectrum antibacterialactivity.Thirty-seven strains of potential probiotics were isolated and the three most potent strains were further characterized fortheir probiotic potential,named as P1-17,P2-33 and P3-11.The three most promising isolates were identified by sequencing the16S rRNA gene and physiological and biochemical characteristics.Strains P1-17 and P2-33 were identified as Bacillus velezensis第 19 卷第 3 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.32023 年 6 月South China Fisheries ScienceJun.，2023收稿日期：2022-09-21；修回日期：2022-11-04基金项目：浙江省基础公益研究计划项目(LGN21C190006)；浙江省农业农村厅协同创新项目(2020XTTGSC04)；国家重点研发计划项目(2020YFD0900803)；2020 年市级第二批现代渔业发展专项资金(舟财农202021 号)作者简介：李张婵(1997)，女，硕士研究生，研究方向为海水养殖病害。E-mail:通信作者：施慧(1978)，女，高级工程师，硕士，研究方向为海水养殖病害。E-mail:and P3-11 was identified as Enterococcus faecalis.According to the hemolytic test and disk diffusion method,none of the threestrains had sigificant hemolytic rings,containing few drug resistance factors,so they had no potential pathogenicity.The resultfrom the artificial infection safety test confirmed that these three strains of antagonistic bacteria had no pathogenicity to healthyL.crocea.The results of the antimicrobial spectrum show that two strains of Bacillus had an antagonistic effect on commonaquatic pathogens such as Vibrio alginolyticus,V.harveyi and Photobacterium damselae.Moreover,two strains of Bacillus couldproduce amylase and protease,while the strain of E.faecalis only had an antagonistic effect on P.plecoglossicida.The studyprovides a scientific basis for the subsequent screening and application of intestinal probiotics in L.crocea.Keywords:Larimichthys crocea;Pseudomonas plecoglossicida;Antagonistic bacteria;Bacillus velezensis;Enterococcus faecalis大黄鱼(Larimichthys crocea)属于硬骨鱼纲、鲈形目、石首鱼科、黄鱼属，主要分布于黄海南部、东海、南海，是我国重要的海水养殖经济鱼类之一1。20 世纪 80 年代初，随着野生大黄鱼资源的枯竭，其养殖产业逐渐兴起，成为浙江省海水养殖主导品种，至 2020 年底，浙江省大黄鱼养殖年产量超 3 万吨，产值近 30 亿元2。随着养殖规模的不断扩大和养殖环境的持续恶化，病害已成为制约大黄鱼养殖业健康发展的主要因素3。内脏白点病是近年来影响大黄鱼养殖的重大病害之一，该病是由杀香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicid)引起的一类细菌性疾病，患病鱼的脾、肾、肝等内脏会出现 12 mm 白色结节，在自然状态下死亡率可达 80%，造成巨大的经济损失4-6。目前由于该病尚无疫苗可用，抗生素依然是养殖生产中预防和治疗该病的首选。但是大黄鱼养殖区域属于开放性水体，开展药物治疗尤为困难，长时间大量使用抗生素，会造成耐药菌株不断增加，破坏养殖生态系统，成品质量安全受到威胁等一系列风险，且药物使用与我国推进的水产养殖业绿色发展理念背道而驰，因此大黄鱼养殖生产中亟需寻找到对养殖环境绿色安全的化学药物替代品。拮抗作用是微生物界的普遍现象，拮抗菌通过营养竞争、分泌抑菌物质等抑制病原微生物的生长，利用拮抗菌来限制病原微生物的生长繁殖是生物防治的有效途径之一7。鱼类消化道是病原微生物的重要侵染部位，因此增强拮抗菌在肠道内的定殖才能达到有效的生物防控效果；有关罗非鱼的研究表明肠道内源性拮抗菌能够迅速在肠道环境中定殖，更好地发挥抑菌效果8。研究显示一些拮抗菌如芽孢杆菌(Bacillus)、乳酸菌等同时还能分泌蛋白酶，促进动物的营养吸收，提高饲料转化效率和蛋白质利用效率，降解有机物，还可以参与病原微生物的细胞壁裂解9-11。目前有关大黄鱼内脏白点病防控拮抗菌的筛选及应用的相关研究报道较少，缺乏可用于大黄鱼内脏白点病生物防控的拮抗益生菌。本研究从大黄鱼肠道中分离筛选具有拮抗大黄鱼内脏白点病致病菌的菌株，并对其形态学、生理生化特征、16S rRNA 系统发育分析、产酶性能、安全性和抗菌谱进行研究，以期丰富杀香鱼假单胞菌的生防微生物资源，为实现大黄鱼内脏白点病的生物防控，推进水产养殖用药减量，保障水产品质量安全，促进大黄鱼养殖的高质量绿色发展提供技术支撑。1 材料与方法 1.1 试验材料试验用大黄鱼样本于 2021 年 110 月采集自舟山朱家尖、东极、嵊泗和六横等海水网箱养殖点，体质量为 100300 g。病原菌杀香鱼假单胞菌1403001，其他致病菌杀香鱼假单胞菌 1303001、1303002、1306002、202010001、202010002、202105001、202105002、202105003、溶藻弧菌(Vi-brio alginolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(Ed-wardsiella tarda)均为本实验室分离保存。主要试剂为 MC 培养基、MRS 肉汤琼脂培养基、酵母培养基、2216E 琼脂、BHI 液体培养基和MH 琼脂培养基，均购于青岛海博生物技术有限公司，血平板购于广东环凯微生物科技有限公司，药敏纸片购于杭州微生物试剂有限公司，API20E 购于法国梅里埃公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP 均购于 TaKaRa 公司。1.2 大黄鱼肠道细菌分离与纯化参照 Olsson 等12的方法，用体积分数 75%的乙醇对大黄鱼体表进行消毒，无菌条件下进行解第 3 期李张婵等:大黄鱼内脏白点病病原拮抗菌的分离鉴定及生物学特性研究79剖，取出中、后肠道，用 15 gL1的无菌生理盐水洗去食物残渣和血液，剪碎匀浆，按 100 mgmL1加入 15 gL1的无菌生理盐水，混匀、沉淀 10 min后取上清液，制成组织菌悬液，将处理好的组织悬液稀释为 3 个梯度(101、102和 103)，取 3 个梯度的稀释液各 100 L 均匀涂布于 MC、MRS 及酵母培养基上，每个稀释度接种 3 个平板，于 28 培养 2448 h，观察细菌生长情况。从菌落清晰、疏密适当且每个平板的菌落数介于 30300 CFU 的培养基上随机挑取大小、颜色和形态不一致的单菌落进行细菌分离，作为鉴定菌种，并在 MC、MRS和酵母菌平板上分离纯化，将纯化后的菌株于80 保存备用。1.3 分离菌株 16S rRNA 序列同源性比对分析利用细菌基因组提取试剂盒提取分离菌的全基因组 DNA 作为 PCR 模板，对其 16S rRNA 进行PCR 扩增，其中引物采用细菌 16S rRNA 通用扩增引物对 27F/1492R，上游引物 27F：5-AGAGTTTG-ATCCTGGCTCAG-3，下游引物 1492R：5-GGT-TACCTTGTTACGACTT-313。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR 反应体系为 50 L：10PCR 缓冲液 5 L，2.5 mmolL1 dNTP 4 L，5 UL1 Taq 聚合酶 0.5 L，10 molL1上、下游引物各 0.5 L，模板 1 L，用无菌去离子水补足 50 L。PCR 循环参数：95 预变性 3 min；95 变性 30 s，56 退火 45 s，72 延伸 1 min，共 35次循环；72 延伸 5 min，10 保存。扩增产物经 1%(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测，然后委托华大基因进行测序，运用 BLAST 软件与 GenBank中的已知序列进行同源性比对分析。1.4 拮抗菌株筛选采用琼脂扩散法14测定分离菌株对杀香鱼假单胞菌的拮抗作用，将大黄鱼源杀香鱼假单胞菌1403001 在 BHI 培养基上划线，28 培养 24 h，用 15 mgmL1无菌生理盐水制成菌悬液，并调整菌液浓度为 106 CFUmL1，取 0.1 mL 菌液均匀涂布于 2216E 培养基上，挑取待检菌株点种于涂布有病原指示菌的 2216E 培养基上，28 培养 2448 h，每个处理组 3 次重复，观察是否出现抑菌圈并测量抑菌圈的直径。1.5 拮抗菌形态学和生理生化鉴定将获得的拮抗菌在 MC 固体培养基上划线培养，28 培养 2448 h，待长出单菌落后观察菌落大小、形状、颜色和透明度等特征，并进行革兰氏染色观察。采用 API 20E 生化鉴定试剂盒进行菌株生理生化特性鉴定，同时参照伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)15和常见细菌系统鉴定手册16，采用细菌微量生化鉴定管补充生化试验。1.6 拮抗菌株 16S rRNA 序列系统发育分析从 GenBank 数据库中下载已登录的相关菌株基因序列，运用 DNAMAN 7 软件，将获得的 3 株菌株的 16S rRNA 基因序列与不同来源的相应菌株进行同源性比对分析；从 GenBank 数据库下载同属菌株的 16S rRNA 基因序列作参考，利用 MEGA7 软件通过邻接法，Kimura-2 法计算遗传距离，采用 Bootstrap(重复次数 1 000)检查聚类树各分支置信度，构建系统发育树。1.7 拮抗菌株安全性检测1.7.1溶血试验参考 Mukherjee 等17的方法并改进，将于 2216E培养基上 28 恒温过夜培养的待测菌株挑取单菌落点种于血平板上，于 28 恒温培养 2448 h，对菌株进行溶血活性分析。若菌落周围出现溶血环，则表明该细菌产溶血素、具有溶血性，是潜在致病菌；若未出现溶血环，则表明该菌株不产溶血素、无溶血能力。1.7.2药敏试验分析根据 CLSI 规定的药物敏感性试验方法18，采用纸片琼脂扩散法，确定拮抗菌株的耐药性。挑取 28 恒温培养 24 h 的待测菌株的单菌落于无菌生理盐水中制备菌悬液，将菌液浊度调整至 0.5个麦氏单位标准，使菌液终浓度达到约 1.5108CFUmL1，取 100 L 制备的菌悬液，均匀涂布 MHA平板，将药敏纸片贴于平板表面，每个处理组 3 次重复，28 培养 1618 h，观察测定抑菌圈直径，根据 CLSI 规定的判断标准进行结果判读。1.7.3人工感染试验将分离到的 3 株拮抗菌于 LB 固体培养基 28 恒温培养 24 h 后，挑取单菌落于 LB 液体培养基过夜培养，6 000 rmin1 离心 5 min，用 PBS 洗涤沉淀 2 次，再用 PBS 重悬，使菌液浓度为 108 CFUmL1。选择规格均一、有活力的健康大黄鱼 体质量(705)g、体长(204)cm 进行安全性回感试验。80南 方 水 产 科 学第 19 卷试验分为 3 个感染组和 1 个对照组，共 4 组，每组 15 尾鱼。采用腹腔注射法对大黄鱼进行人工感染试验，每尾注射 0.2 mL 菌悬液，对照组注射等量的 PBS。试验水温 21，连续充气，不投喂，连续观察 7 d，记录死亡情况。第 7 天解剖所有试验鱼，观察内脏是否正常，并每组随机挑取 8 尾鱼的内脏组织，在 MC 培养基上进行细菌划线分离。1.8 拮抗菌株产酶特性鉴定采用点种法19对拮抗菌株进行产酶特性检测，将于 2216E 培养基上 28 恒温过夜培养的待测菌株分别点种到含 1%酪蛋白的 2216E 培养基、含 1%可溶性淀粉的 2216E 培养基、含 1 mL 吐温80 的 2216E 培养基上，每个处理组 3 个平行，28 恒温培养 24 h，观察菌落周围是否产生水解圈；淀粉培养基需采用卢戈氏碘液着色后观察菌落周围是否产生水解圈，并测量菌落直径(Dc)和水解圈直径(Dh)，根据水解圈直径与菌落直径之比(Dh/Dc)判断拮抗菌株产酶能力大小。1.9 拮抗菌抗菌谱的测定将实验室保存的从患病大黄鱼上分离的杀香鱼假单胞菌菌株(1303001、1303002、1306002、202010001、202010002、202105001、202105002 和202105003)、溶藻弧菌、哈维氏弧菌以及其他水产动物分离的致病菌副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌分别在 BHI 培养基上划线，28 培养 24 h，用 1.5%无菌生理盐水制成菌悬液，并调整菌液浓度为 106 CFUmL1，取 0.1 mL 菌液均匀涂布于 2216E 培养基上，挑取筛选出的拮抗菌株点种于涂布有病原菌的 2216E 培养基上，28 培养 2448 h，每个处理组 3 次重复，进行抗菌谱测定。2 结果 2.1 候选菌株的分离与筛选利用 MC 培养基、MRS 肉汤琼脂培养基、酵母菌富集培养基从大黄鱼肠道组织悬液筛选，分离到 228 株候选细菌，通过 16S rRNA 基因序列扩增及同源性比对分析，共筛选出 37 株益生菌作为候选菌株。2.2 候选菌株拮抗菌的筛选采用琼脂扩散法对 37 株候选菌株进行杀香鱼假单胞菌 1403001 抗菌活性检测，共筛选出 3 株菌对所选杀香鱼假单胞菌 1403001 有拮抗作用，分别命名为 P1-17、P2-33 和 P3-11。3 株菌对杀香鱼假单胞菌的抑菌圈直径分别为(10.830.2)、(10.360.62)和(12.751.24)mm。2.3 拮抗菌株鉴定2.3.1拮抗菌株生理生化鉴定结果将菌株 P1-17、P2-33 和 P3-11 在 MC 培养基上培养 2448 h，菌落形态见图 1。P1-17、P2-33 在MC 培养基上边缘整齐，向上突起，表面干燥，多皱；P3-11 在 MC 培养基上菌落细小，呈乳白色球形，表面光滑。革兰氏染色结果显示(图 2)，菌株P1-17 和 P2-33 呈蓝紫色短杆状，培养 48 h 可见芽孢；菌株 P3-11 呈蓝紫色球形，成对排列，无芽孢；3 株菌均为革兰氏阳性菌。菌株的主要生理生化特征(表 1)试验结果表明，菌株 P1-17、P2-33 的生理生化特征一致，均能利用蛋白胨水、阿拉伯糖，VP(Voges-Proskauer)试验、明胶液化试验均为阳性，OF(葡萄糖氧化发酵)试验、柠檬酸盐试验、吲哚试验均为阴性，氧化酶试验为阴性，不能利用大部分糖，邻硝基苯-半乳糖苷酶、硫化氢、尿素酶，为阴性；P3-11 能利用蛋白胨水、蔗糖、阿拉伯糖、葡糖糖、甘露P1-17 P2-33 P3-11 图1 拮抗菌P1-17、P2-33、P3-11菌落形态Fig.1 Colony morphology diagram of antagonistic bacteria P1-17,P2-33 and P3-11第 3 期李张婵等:大黄鱼内脏白点病病原拮抗菌的分离鉴定及生物学特性研究81醇、肌醇、山梨醇、苦杏仁苷，不能利用乳糖、甘露糖、鼠李糖、密二糖，VP、明胶液化、吲哚试验为阳性，OF 试验、邻硝基苯-半乳糖苷酶、柠檬酸盐、硫化氢、尿素酶为阴性。2.3.2拮抗菌株的16S rRNA基因分析结果运用 DNAMAN 软件对菌株 P1-17(登录号:OM060679)和 P2-33(登录号:OM060683)的 16SrRNA 基因序列进行比对分析，两者同源性为100%，与 GenBank 中贝莱斯芽孢杆(Bacillusvelezensis)(MK130896)的同源性为 100%；菌株 P3-11 的 16S rRNA 基因序列(登录号:OM019305)与GenBank 中粪肠球菌(Enterococcus faecalis)(NR115765)序列同源性为 100%。利用 MEGA 软件采用邻接法进行系统发育树构建，菌株 P1-17 和 P2-33 与贝莱斯芽孢杆菌(登录号:NR075005、MK130896、MK208528、MN093810、MH210868)亲缘关系最近，自然聚为同一分支(图 3)，结合菌株的生理生化特征判断菌株 P1-17 和 P2-33 属于同一菌属，为贝莱斯芽孢杆菌；菌株 P3-11 与 GenBank 中已登录的 5 株粪肠球菌(登录号:NR114782、NR115765、NR113902、MW829540、NR040789)亲缘关系最近，自然聚为同一分支(图 4)，结合菌株的生理生化特征判断菌株 P3-11 为粪肠球菌。2.4 大黄鱼肠道拮抗菌株的药敏试验结果根据 CLSI 规定的判断标准，分析了 3 株拮抗菌对 10 大类 29 种抗生素的药物敏感性(表 2)，其中菌株 P1-17、P2-33 除了对制霉菌素耐药，对诺氟沙星等其余 28 种抗生素均高度敏感；菌株 P3-11 对诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、恩诺沙星、青霉素、氟苯尼考、多西环素、万古霉素等 10 种抗生素高度敏感，对洛美沙星、阿莫西林、新生霉素、四环素、罗红霉素等 5 种抗生素中度敏感，对氨苄西林、头孢噻肟、头孢曲松、氯霉素、链霉素、丁胺卡那、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、磺胺异恶唑、复方新表1 菌株P1-17、P2-33、P3-11的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics ofStrains P1-17,P2-33 and P3-11鉴定项目Tested item菌株 StrainP1-17P2-33P3-11蛋白胨水 peptone water+蔗糖 Sucrose+甘露糖 Mannose阿拉伯糖 Pectinose+乳糖 Lactose葡萄糖氧化发酵试验 OF邻硝基苯-半乳糖苷酶o-nitrophenyl-galactosidase柠檬酸盐 Citrate硫化氢 H2S尿素酶 UreaseVP试验 Voges-Proskauer test+明胶液化 Gelatin Liquefaction+吲哚试验 Indole test+葡萄糖 Glucose+甘露醇 Mannitol+肌醇 Inositol+山梨醇 Sorbitol+鼠李糖 Rhamnose密二糖 Melibiose苦杏仁苷 Amygdalin+氧化酶试验 OX注：+.阳性；.阴性。Note:+.Positive;.Negative.10 mP1-17 P2-33 P3-11 10 m10 m图2 拮抗菌P1-17、P2-33、P3-11革兰氏染色图Fig.2 Gram staining of antagonistic bacteria P1-17,P2-33 and P3-1182南 方 水 产 科 学第 19 卷诺明、阿奇霉素、多黏菌素 B、制霉菌素等 14 种抗生素耐药。2.5 拮抗菌株安全性分析结果菌株 P1-17、P2-33 和 P3-11 在血平板上培养2448 h 后，菌落生长良好，未观察到溶血现象，说明 3 株分离菌均不产溶血素，无溶血性。安全性回感试验结果显示，3 个拮抗菌注射组及 PBS 对照组的试验鱼在试验期间无发病症状、无死亡情况；7 d 后解剖所有试验鱼，其内脏组织未见异常，试验鱼内脏组织均未分离到细菌，表明菌株 P1-17、P2-33、P3-11 对大黄鱼无致病性。2.6 拮抗菌产酶能力拮抗菌 P1-17、P2-33 在蛋白酶平板和淀粉酶平板上均出现了水解圈，说明其具有产蛋白酶和淀粉酶的能力，两株菌在脂肪酶平板上未出现水解圈，表明两株菌均不产脂肪酶。拮抗菌 P3-11 在淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶平板上均未出现水解圈。水解圈直径与菌落直径之比见表 3。2.7 拮抗菌抗菌谱的测定菌株 P1-17、P2-33 对 8 株杀香鱼假单胞菌均具有拮抗作用，对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等致病菌也有拮抗作用，菌株 P3-11 对 8 株杀香鱼假单胞菌有拮抗作用，但对溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌无拮抗作用(表 4、表 5)。3 讨论研究表明益生菌可以调节机体免疫机能，增加内源性益生菌的增殖，像芽孢杆菌、乳酸杆菌等一些具有拮抗特性的益生菌株通过分泌一些拮抗物质，如小分子抗生素、多肽抗生素以及蛋白质类抗菌物质，能有效抑制肠道中细菌和真菌等有害微生物的生长繁殖，在病害防治方面前景广阔20-23。本研究的目的是从健康大黄鱼肠道中分离出潜在的内源性益生菌，同时这些菌株可以有效地拮抗大黄鱼内脏白点病致病菌杀香鱼假单胞菌。从大黄鱼肠道中共筛选到 3 株对杀香鱼假单胞菌有拮抗作用的菌株，经鉴定菌株 P1-17、P2-33 为贝莱斯芽孢杆菌，菌株 P3-11 为粪肠球菌。拮抗菌株的安全性P2-33 P1-17 贝莱斯芽孢杆菌 Tr02M Bacillus velezensis strain Tr02M(MH210868)贝莱斯芽孢杆菌 BvL03 Bacillus velezensis strain BvL03(MN093810)贝莱斯芽孢杆菌 F1F2 Bacillus velezensis strain F1F2(MK208528)贝莱斯芽孢杆菌 TPSA Bacillus velezensis strain TPSA(MK130896)贝莱斯芽孢杆菌 FZB42 Bacillus velezensis strain FZB42(NR075005)解淀粉芽孢杆菌 NBRC Bacillus amyloliquefaciens strain NBRC(NR041455)解淀粉芽孢杆菌 MPA Bacillus amyloliquefaciens strain MPA(NR117946)枯草芽孢杆菌 AP-MSU Bacillus subtilis strain AP-MSU(HQ616142)枯草芽孢杆菌 IAM Bacillus subtilis strain IAM(NR112116)耐盐芽孢杆菌 GNC06 Bacillus halotolerans strain GNC06(OL824995)耐盐芽孢杆菌 CR-95 Bacillus halotolerans strain CR-95(NR115282)地衣芽孢杆菌 ATCC Bacillus licheniformis strain ATCC 地衣芽孢杆菌 APS2 Bacillus licheniformis strain APS2(HQ634792)短小芽孢杆菌 AQ1/1B Bacillus pumilus strain AQ1/1B 短小芽孢杆菌 ATCC Bacillus pumilus strain ATCC(NR043242)蜡样芽孢杆菌 NQ-2018-8 Bacillus cereus strain NQ-2018-8(MW793908)蜡样芽孢杆菌 TF4 Bacillus cereus strain TF4(DQ120941)凝结芽孢杆菌 NBRC Bacillus coagulans strain NBRC(NR041523)凝结芽孢杆菌 SL5 Bacillus coagulans strain SL5(AB557590)环状芽孢杆菌 USC24 Bacillus circulans strain USC24(HQ441221)环状芽孢杆菌 CL-10 Bacillus circulans strain CL-10(MN877635)10010010010058100100939779969094890.005图3 基于菌株P1-17、P2-33及相关菌株16S rRNA基因序列的系统发育树注：括号中的序号代表菌株的 GenBank 登录号；分支点上的数字代表 bootstrap 值；标尺刻度代表碱基替代率。图 4 同此。Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences of Strains P1-17,P2-33 and other related strainsNote:The sequence number in the brackets is the GenBank accession number of the strain;the numbers at the node are the bootstrap values;the scalebar indicates nucleotide substitution ratio.The same case in Fig.4.第 3 期李张婵等:大黄鱼内脏白点病病原拮抗菌的分离鉴定及生物学特性研究83试验结果表明 3 株拮抗菌无溶血毒性，对大黄鱼无致病性。同时抗菌谱试验结果显示，筛选获得的菌株 P1-17、P2-33 具有广谱拮抗性，对其他水产致病菌如溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、美人鱼发光杆菌和嗜水气单胞菌等均具有拮抗作用，有较好的潜在应用前景。大黄鱼内脏白点病是当前大黄鱼养殖过程中危害最为严重的细菌性疾病之一，每年 11 月至翌年5 月的低水温期是该病的主要流行季，由此造成的经济损失约占养殖大黄鱼总产值的 10%。目前，大黄鱼养殖企业为了预防该病，多选择使用抗生素类药物，但这类预防措施不仅增加了经济成本，而且通过药物的筛选压力会导致病原菌群体的抗药性比例增加。据报道，大黄鱼内脏白点病致病菌对恩诺沙星、氟苯尼考、磺胺类药物等多种水产养殖药物耐受24，所以亟待开发安全、高效、可持续的绿色防控药物。目前已有不少关于大黄鱼致病菌拮抗菌的报道，王娟等25从健康的大黄鱼肠道内分离获得了 3 株对大黄鱼病原菌溶藻弧菌具有较好拮抗作用的菌株，分别为类产碱假单胞菌(P.pseudoalca-ligenes)、恶臭假单胞菌(P.putida)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)；王梦霞等26研究表明，分离自海域潮间带海洋生物体中的两株灰平链霉菌(Strep-tomyces griseoplanus)，可以有效拮抗大黄鱼的致病菌哈维氏弧菌，但上述研究均未对拮抗菌的安全性展开分析。傅超英等27研究发现，一株从大黄鱼周边养殖环境中分离获得的粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)可以对溶藻弧菌和杀香鱼假单胞菌产生拮抗作用，且对大黄鱼无致病性，但未对拮抗菌株进行药敏分析。本研究获得的 2 株贝莱斯芽胞杆菌，棉子糖屎球菌 S1-23 Enterococcus raffinosus strain S1-23(MF327670)棉子糖屎球菌 1789-79 Enterococcus raffinosus strain 1789-79(NR 026499)病臭肠球菌 HN77 Enterococcus malodoratus strain HN77(HQ009758)病臭肠球菌 ATCC 43197 Enterococcus malodoratus ATCC 43197(NR 114453)鸟肠球菌 16049 Enterococcus avium strain 16049(MW479211)鸟肠球菌 ATCC 14025 Enterococcus avium ATCC 14025(NR 114777)假鸟肠球菌ATCC 49372 Enterococcus pseudoavium ATCC 49372(NR 115762)假鸟肠球菌 LZU-28 Enterococcus pseudoavium strain LZU-28(KT262972)蒙氏肠球菌 ATCC 43186 Enterococcus mundtii ATCC 43186(NR 024906)蒙氏肠球菌 NBRC Enterococcus mundtii strain NBRC(AB681188)海氏肠球菌 ATCC 9790 Enterococcus hirae ATCC 9790(NR 075022)海氏肠球菌 NBRC 3181 Enterococcus hirae strain NBRC 3181(NR 113574)坚忍肠球菌 B1 Enterococcus durans strain B1(MF197403)坚忍肠球菌 S3 Enterococcus durans strain S3(MH628095)屎肠球菌 HPRTGL206 Enterococcus faecium strain HPRTGL206(MH393916)屎肠球菌 TBT2 Enterococcus faecium strain TBT2(MN955419)铅黄肠球菌 EC2 Enterococcus casseliflavus strain EC2(MH376403)铅黄肠球菌 RTCLI14 Enterococcus casseliflavus strain RTCLI14(KM654558)鹑鸡肠球菌 F1H3 Enterococcus gallinarum strain F1H3(MK208529)鹑鸡肠球菌 NBRC 100675 Enterococcus gallinarum NBRC 100675(NR 113924)孤立肠球菌 Enterococcus solitaries(AF061010)孤立肠球菌 Enterococcus solitaries(Y18338)粪肠球菌 LMG 7937 Enterococcus faecalis strain LMG 7937(NR 114782)粪肠球菌 ATCC Enterococcus faecalis strain ATCC(NR