ATRX、P53表达的相关...合多因素对胶质瘤预后的意义_许儒.pdf

DOI:103969/j issn1672-7770 2023 02007胶质瘤基础ATRX、P53 表达的相关性及联合多因素对胶质瘤预后的意义许儒，阴鲁鑫，华磊，陈洋，朱天霸，赵光，王星淇，高文昌【摘要】目的探讨脑胶质瘤患者中 ATRX 失表达与 P53 过表达的相关性，并分析二者与临床多因素在胶质瘤诊断及预后中的意义。方法收集 2014 年 1 月2020 年 12 月徐州医科大学附属医院神经外科收治的术后病理诊断为胶质瘤的患者 92 例，其中包括星形细胞瘤(WHO、级)30 例、少突胶质细胞瘤(WHO、级)50 例、胶质母细胞瘤(WHO 级)12 例，并使用免疫组织化学染色法检测 ATRX 与 P53 表达情况，并统计不同年龄、性别与二者间的关系;2检验分析 ATRX 失表达、P53 过表达与不同病理类型脑胶质瘤的关系且二者表达之间的关系用 Spearman 等级相关分析法检验;Kaplan-Meier 生存曲线分析二者对胶质瘤患者预后的影响，其他临床因素纳入多因素 Cox 回归分析。结果ATRX 与 P53 表达与胶质瘤病理类型相关(P 005);相关性分析显示，胶质瘤中 ATRX 与 P53 表达呈负相关(r=0580，P 001);多因素分析表明，胶质瘤患者的年龄60 岁、病理分级 WHO 级、术前 KPS 评分 60 分、术后无放化疗、肿瘤直径5 cm、肿瘤非全切、ATRX 失表达、P53 过表达是预后不良的独立危险因素(P 0 05)。结论在人脑胶质瘤患者中，ATRX失表达与 P53 过表达密切相关，与临床其他多因素联合可更好地对胶质瘤患者的预后进行评估。【关键词】脑胶质瘤;ATRX;肿瘤抑制蛋白质 P53;免疫组化;预后【中图分类号】R739 41【文献标志码】A【文章编号】1672-7770(2023)02-0153-06Correlation of ATRX and P53 expression and prognostic significance of combination ofmultiple factors in glioma XU Ru，YIN Lu-xin，HUA Lei，et al Department of Neurosurgery，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University，Xuzhou 221000，ChinaCorresponding author:GAO Wen-changAbstract:ObjectiveTo explore the correlation between the loss of expression of alphathalassemia with mental retardation syndrome gene(ATRX)and over expression of P53 in patients withglioma and to analyze the clinical significance of the two gene expression and multi-factors in thediagnosis and prognosis of glioma MethodThe clinical data of 92 patients were collected，including 30patients with astrocytoma of grade/(WHO)，50 with oligodendroglioma of grade/(WHO)and 12with glioblastoma of grade(WHO)The Chi-square test was applied to analyze the relationshipbetween the two gene expression and different pathological types of glioma The Spearmans rankcorrelation analysis was used to analyze the correlation between their different expression Kaplan-Meiersurvival curve was designed to investigate the clinical value of their different expression in prognosis ofpatients with glioma The other contributing factors were analyzed in the multivariate Cox regressionanalysis ResultsThere was a correlation between the different expression of ATRX and P53 and thepathological types of glioma(P 0 05)The correlation analysis showed that the loss of expression ofATRX and over expression of P53 in glioma were negative correlated(r=0 426，P 0 01)Themultivariate analysis showed that the age over 60 years old，grade/(WHO)，preoperative KPSscores below 60 points，lack of postoperative radiotherapy and chemotherapy，and lost expression of theATRX were independently risk factors for poor prognosis ConclusionIn patients with glioma，the lossof expression of ATRX and over expression of P53 were closely related to one another，and they togetherwith other clinical factors can better evaluate the prognosis of glioma patientsKey words:glioma;ATRX;tumor suppressor protein P53;immunohistochemistry;prognosis基金项目:江苏省自然科学基金面上项目(BK20181152)作者单位:221000 徐州，徐州医科大学附属医院神经外科通信作者:高文昌351临床神经外科杂志 2023 年第 20 卷第 2 期脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，占颅内原发肿瘤的 40%60%1。根据肿瘤的恶性程度分为 WHO 低级别胶质瘤，级高级别胶质瘤。高级别肿瘤与低级别相比，一般患者生存期更短，预后较差。现在更多基因和染色体被发现与人脑胶质瘤的发生、发展及预后有着高度的联系2，有学者发现，胶质瘤患者的预后状况与细胞的凋亡有关，而细胞的凋亡又与基因或蛋白的调控相关联3。自 2016 年 WHO 发布了胶质瘤的第四版本的诊断标准，胶质瘤就进入了“组织学+分子病理”的诊 断 模 式，其 中 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶(isocitratedehydrogenase，IDH)的野生型与突变型作为分类的首个分子标记物，对于胶质瘤的诊断有着极其重要的意义，其次是 地中海贫血伴智力低下综合征基因(alpha-thalassemia/mental retardation syndrome X-linked，ATRX)与 P53，1p/19q，其中 ATRX 与1p/19q的突变不会同时发生，把胶质瘤的常见类型分为弥漫星形细胞瘤 IDH 突变型、少突胶质细胞瘤 IDH 突变，1p/19q 共缺失、弥漫性星形细胞瘤，IDH 野生型、少突胶质细胞瘤、NOS 等。然而 ATRX 基因异常表达的致病机制仍不十分明确，其治疗靶向的可处理机制也不清楚。ATRX 作为端粒维持基因，与肿瘤细胞发生端粒替代延长机制(ALT)有关，而P53 对端粒酶的作用也有一定的影响4 在胶质瘤的发展进程中同样起重要作用。本研究回顾性分析2014 年 1 月2020 年 12 月在徐州医科大学附属医院神经外科初次行手术切除并经病理检查确诊的胶质瘤标本 92 例，使用免疫组织化学方法对上述标本进行处理，分析 ATRX 失表达及 P53 过表达情况并分析二者在胶质瘤发展过程中的某条或多条途径中的共同作用及联合临床其他多因素对于胶质瘤预后的关系。1资料与方法1 1一般资料共纳入 92 例脑胶质瘤患者标本，其中男 50 例，女 42 例;年龄 22 74 岁，平均年龄48 5 岁;星形细胞瘤(WHO、级)30 例，少突胶质细胞瘤(WHO、级)50 例，胶质母细胞瘤(WHO 级)12 例;对患者本人或家属进行电话随访，随访内容包括患者术后是否进行放化疗，是否死亡及死亡时间。随访时间自患者手术日开始，截止日期为 2020 年 12 月。纳入标准:(1)原发脑胶质瘤;(2)病理检查确诊为胶质瘤;(3)初次行手术治疗;(4)术后联合放化疗;(5)患者资料完善可进行有效随访，并取得患者知情同意。排除标准:(1)合并其他系统的原发肿瘤;(2)入院前对胶质瘤有其他治疗;(3)入院前肝肾功能、电解质、凝血功能明显异常;(4)入院前近期有慢性或急性感染病史。1 2试剂ATRX 多克隆抗体、P53 单克隆抗体均购自北京中杉金桥公司，DAB 显色剂、EDTA(PH84)修复液、PBS 缓冲液、二抗均购自罗氏(上海)公司。1 3标本制作手术切除肿瘤组织均经 10%中性福尔马林固定，HE 染色;石蜡包埋，4 m 厚连续切片，每个切片均行 HE 染色。1 4免疫组织化学染色切片脱蜡后分别滴加ATRX 多克隆抗体、P53 单克隆抗体行免疫组化EnVision 法染色，染色步骤严格按试剂盒说明书进行:DAB 显色、苏木精复染、返蓝、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，以 PBS 缓冲液代替一抗作为阴性对照。15判断标准结果由两位有经验的病理医师阅片后，取得一致意见。以肿瘤周围正常细胞作为内对照，免疫组化结果以肿瘤细胞核棕褐色为阳性细胞。光镜下随机选择数个高倍视野，记录每个视野中阳性细胞所占的百分率，采用染色判定标准5 7。肿瘤细胞中，ATRX 阳性肿瘤细胞数 10%即ATRX 表达，ATRX 阳性细胞数10%即 ATRX 失表达;P53 阳性细胞数 10%即 P53 过表达，P53 阳性细胞数10%即 P53 阴性。1 6统计学方法采用 SPSS 26 0 软件进行数据统计分析;2检验分析 ATRX、P53 表达与不同类型胶质瘤的关系;ATRX 与 P53 表达之间的关系用Spearman 等级相关分析法检验;ATRX 与 P53 表达与胶质瘤患者生存时间的关系用 Kaplan-Meier 生存曲线表示，再采用多因素 Cox 回归分析，以 P 0 05为差异有统计学意义。2结果2 1人口学统计结果在 60 岁患者中，男性患者 ATRX 失表达与 P53 过表达的发生率分别是3947%、40 62%，女性患者中为 37 50%、2812%;在60 岁患者中，男性患者 ATRX 失表达与 P53 过表达的发生率分别是 33 33%、66 67%，女性患者中分别为 30 00%、40 00%，ATRX 失表达与 P53 过表达更加倾向于年轻患者，而在不同性别中无明显差别，P 0 05(表 1)。2 2ATRX 失表达、P53 过表达与不同病理类型胶质瘤的关系ATRX 失表达、P53 过表达与胶质瘤病理类型及级别有关。ATRX 失表达情况:(1)不同病理类型肿瘤中，星形细胞瘤(WHO、级)451J Clin Neurosurg，April 2023，Vol 20，No 2表 1各年龄组及性别组中 ATRX 失表达及 P53 过表达的情况年龄男性人数女性人数总计男性ATRX 失表达(%)P53 过表达(%)女性ATRX 失表达(%)P53 过表达(%)60 岁38327015(39 47)13(4062)12(3750)9(28 12)60 岁1210224(33 33)8(6667)3(3000)4(40 00)总计50429219(38 00)21(3889)15(3571)13(34 21)ATRX 失表达百分比为 76 67%(23/30)，少突胶质细胞瘤(WHO、级)中为 2 00%(1/50)，ATRX突变在二者中的差异具有统计学意义(P 0 05);(2)不同级别肿瘤中，WHO 级 ATRX 失表达百分比为 22 91%(11/48)，WHO 级中为 40 62%(13/32)，WHO 级中为 83 33%(10/12)(P 0 05，表 2，图 1A)。P53 过表达情况:(1)在星形细胞瘤(WHO、级)中 P53 过表达百分比为60 00%(18/30)，少突胶质细胞瘤(WHO、级)中为 14 00%(7/50)，P53 过表达在二者中的差异具有统计学意义(P 0 05);(2)不同级别肿瘤中，WHO 级 P53 过表达百分比为 18 75%(9/48)，WHO 级中为 45 71%(16/32)，WHO 级中为75 00%(9/12)(P 0 05，表 2，图 1B)。表 2ATRX、P53 在不同病理类型及级别胶质瘤中的表达病理分类例数ATRX 失表达 P53 过表达星形细胞瘤(WHO 级)16(17 39)10(10/16)6(6/16)星形细胞瘤(WHO 级)14(15 21)13(13/14)12(12/14)少突胶质细胞瘤(WHO 级)32(34 78)1(1/32)3(3/32)少突胶质细胞瘤(WHO 级)18(19 57)04(4/18)胶质母细胞瘤(WHO 级)12(13 04)10(10/12)9(9/12)总计92(100 00)34(36 96)34(3696)A:胶质瘤组织中 ATRX 失表达;B:胶质瘤组织中 P53 过表达(免疫组化 EnVision 法染色，400)图 1胶质瘤中 ATRX 失表达、P53 过表达的病理学检查结果2 3ATRX 与 P53 表达之间的关系本研究进一步对 ATRX 与 P53 表 达 情 况 进 行 分 析，发 现Spearman 相关系数 r=0 580，P 0 01，二者存在负相关系(表 3)。表 3胶质瘤中 ATRX 与 P53 突变的相关性分析ATRXTP53 基因+r 值P 值+9492590580001总计34582 4K-M 曲线分析 ATRX 与 P53 表达对胶质瘤患者预后的影响ATRX 失表达患者预后差于 ATRX 表达的患者，其生存时间少于 ATRX 表达的患者，P 005。P53 过表达患者的预后差于 P53 阴性的患者，其生存时间少于 P53 阴性的患者，P 005(图2)。A:ATRX 表达与胶质瘤预;B:P53 表达与胶质瘤预后图 2Kaplan-Meier 生存曲线2 5影响胶质瘤患者预后的多因素回归分析Cox回归分析显示，胶质瘤患者的年龄60 岁，病理分级 WHO 级、级，术前 KPS 评分 60 分，术后无放化疗、肿瘤直径5 cm、肿瘤非全切、ATRX 失表达、P53 过表达是预后不良的独立危险因素(P 0 05)。而患者的性别不是危险因素。见表 4。表 4临床影响因素与患者预后的 Cox 回归分析P 值RR950%CI下限上限性别0113221509124878年龄(60 岁/60 岁)001107410311119病理分级(WHO、级/级)00383613099713211KPS 评分(60/60)0025198008461275术后放化疗(是/否)0014364411349943肿瘤直径5 cm/5 cm00073102121411546肿瘤全切/非全切00083496133812647ATRX 失表达0000398917678895P53 过表达0001365518729135551临床神经外科杂志 2023 年第 20 卷第 2 期3讨论近年来，越来越多的研究都揭示了端粒维持基因对于胶质瘤患者预后的重要性，其中就包括ATRX。ATRX 是位于 Xq21 1 上，编码 280 kDa 的核蛋白，已被证明涉及广泛的细胞功能，如 DNA 重组、修复和转录调控。P53 基因可分为野生型及突变型，野生型 P53 可以抑制正常细胞发生癌变，一般情况下会使细胞的分裂增殖正常进行，若细胞受到不可恢复的损伤，P53 将会使受损伤的细胞发生凋亡。P53 是多种抗增殖功能的主要调节因子，P53的突变和/或失活对肿瘤发生至关重要7。在胶质瘤中，P53 有较高的突变率以维持肿瘤细胞的活性8。有关研究认为，P53 过表达的患者与 P53 阴性的患者相比，预后更差9。通常，ATRX 突变会导致蛋白截断和蛋白表达消失5，且 ATRX 突变状态与表达水平相关，内皮细胞、皮层神经元和浸润性炎症细胞普遍阳性，作为内阳性对照6，所以免疫组化法是可靠的，可以代替基因检测来评估 ATRX 基因突变。有研究通过荟萃分析及系统性回顾等方法来探究 P53 免疫组化作为 TP53 测序替代物的诊断准确性，结果显示 P53的免疫组化是 TP53 测序的高度准确替代品10，因此在本研究中，用免疫组化方法对于检测 ATRX 及P53 突变具有研究意义。有研究提出11，在脑肿瘤的形成过程中，ATRX 作为基因改变的终末事件，发生于 IDH、P53 之后，三个致癌基因共同通过阻断神经干细胞的分化来导致胶质瘤的发展。ATRX 缺失会引起端粒功能的障碍，且内源性端粒酶活性是无法代偿的12，因此，ATRX 突变细胞被迫采用基于DNA 修复的 ALT 代替端粒酶激活，作为永生化的代偿性端粒延伸机制;此外，也有学者认为 ATRX 失表达可诱导微核形成13。因此，ATRX 缺失诱导的ALT 也可在胶质瘤中诱发基因组的不稳定。另一方面，有研究显示14:ALT 细胞中固有的 DNA 损伤会诱导低水平的 P53 表达，虽不足以启动凋亡相关基因的转录，但足以刺激 mTORC2 关键成分的表达，进而导致 AKT 的磷酸化，而活化的 AKT(p-AKT)可由此刺激下游抗凋亡事件的发生，P53 和 AKT 是抑制 ALT 细胞自发凋亡的关键因素。因此，P53 基因的突变在 ALT 通路中也同样扮演了重要作用15。由此可知，ATRX 与 P53 共同在 ALT 通路中产生影响，使肿瘤细胞进一步进展。有研究表明16 18，ATRX 定位于早 幼 粒 细 胞 白 血 病(promyelocyticleukemia，PML)核体以及其他部位，因此，ATRX 可能在基因表达调控中产生重要影响，且死亡结构域蛋白 DAXX 可将 ATRX 招募到 PML 核体中发挥作用17，因此，若 ATRX 基因异常表达则使 PML 的抑制肿瘤作用发生改变。相关研究显示19，PML 核体(NBs)的形成受到细胞应激的刺激，并依赖于蛋白质-蛋白质之间的相互作用，从而建立 PML 蛋白质网络，该网络能够招募肿瘤抑制基因 P53 以及其他P53 修饰物，从而控制 P53 的翻译后的修饰及其活性，进而调节细胞过程。因此，ATRX 与 P53 也可以通过 PML 共同调控细胞相关的生理过程。另外，ATRX-DAXX 复合物通过在端粒和中心异染色质及其他 DNA 重复区域沉积 H3 3，在维持基因组稳定性方面发挥关键作用，因此，ATRX 的丢失使 H3 3沉积消失，导致细胞中特定位点染色质的变性，这些都表现了 ATRX 作为癌症驱动因素的作用13。Wang 等20 研究发现，ATRX 失表达可能通过 G4 介导的相关机制导致 DNA 损伤或者染色体结构改变。而且，G4 结构的化学稳定性也选择性地促进了ATRX 缺陷环境下的细胞死亡。一个 ATRX 缺陷的基因工程胶质瘤模型也表明，ATRX 的失表达降低了中位生存期，增加了遗传不稳定性13。本研究表明，ATRX 突变失表达多发生于星形胶质瘤，但少见于少突胶质细胞瘤(表 2)，对于星形细胞瘤的诊断及鉴别具有意义，ATRX 失表达患者的生存期比 ATRX 表达患者有变差的趋势(图2A)，而对于 P53 过表达的患者预后也差于 P53 阴性患者(图2B)，对于预测患者的预后有一定的意义。且本研究进一步对 ATRX 与 P53 表达情况进行分析，发现 Spearman 相关系数 r=0 580，P 0 01，二者存在负相关系(表 3)，这与相关研究认为 ATRX 与P53 基因异常表达在级星形细胞瘤中常见这一观点保持一致21。有研究22 23 也认为 ATRX 失表达与 P53 过表达在星形细胞瘤中多于少突胶质细胞瘤，并有助于星形细胞瘤的诊断(表 2)，所以 P53 可以联合 ATRX 对星形细胞瘤进行诊断和鉴别。但在既往研究中有结论显示，ATRX 失表达可以延长患者总生存时间，这可能是因为在临床中存在 IDH2突变而使用免疫组化不能检测使结果存在偏差，所以结果还需进一步进行研究讨论。以上结果显示，ATRX 失表达、P53 过表达在胶质瘤的发生、发展过程中有一定的影响，对于患者预后也有一定的预测作用。其他临床因素也会对胶质瘤患者的预后产生一定的影响，本研究结果发现(表 4)，患者年龄，肿瘤病理级别，术前 KPS 评分，术后放化疗，肿瘤直径，651J Clin Neurosurg，April 2023，Vol 20，No 2肿瘤切除程度也是影响胶质瘤患者预后的因素。有研究表明24，相对于年轻患者，年龄较大患者预后更差，可能与某些基因随着年龄的增加而出现较大的突变风险有关。术前 KPS 评分在患者术前的身体健康状态评估方面有一定的作用;在患者病理类型确定的情况下，越是低级别的胶质瘤，细胞的异型性就越小，肿瘤细胞的侵袭与进展的可能性越低，患者预后越好。在胶质瘤的患者中，放化疗可以有效延长患者生存期25。患者术后放化疗可增加患者恢复的速度，减少肿瘤的早期转移可能性和减缓肿瘤后期进展速度。目前，手术切除仍是脑胶质瘤的主要治疗方式，手术的切除程度与患者的预后息息相关。本研究结果显示，肿瘤全切对于患者预后优于非全切的患者，结果与目前研究结论一致26 28。因此，对于行手术治疗的患者，最大范围的进行安全切除仍作为一线治疗29。综上所述，ATRX 与 P53 的表达与胶质瘤病理类型有关，且二者呈负相关，联合检测 ATRX、P53 及临床多因素有利于判断胶质瘤病理类型、恶性程度及预测患者生存时间，从而给胶质瘤的鉴别诊断、预后判断和精准诊疗提供更加可靠的理论支持。利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献 1吴维宁，吴有志，刘振，等 高级别胶质瘤患者生存期的影响因素分析J 临床神经外科杂志，2020，17(6):669 674 2李卓，朴月善，张立彦，等 ATRX 在胶质瘤诊断及患者预后评估中的应用 J 中华病理学杂志，2017，46(10):690 694 3张国栋，鞠海涛，黄平，等 脑胶质瘤的基因治疗与病毒治疗研究进展J 临床神经外科杂志，2021，18(2):237 240 4Benslimane Y，Snchez-Osuna 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影响胶质瘤细胞的生物学行为，可能是胶质瘤分子靶点，靶向 XIST/miR-543 可能是治疗胶质瘤的新兴方法，这对临床治疗胶质瘤而言是有意义的发现。但本研究亦存在一些缺陷，比如仅从敲低 XIST 了解其对胶质瘤细胞生物学行为的影响，未能从过表达 XIST 方面验证本研究的结论，且单纯观察了胶质瘤细胞增殖活性、凋亡率，未能观察敲低 XIST 对胶质瘤细胞侵袭、迁移等生物学行为的影响，这些未来会进一步完善。利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献 1王雅宁，王月坤，孔梓任，等 老年高级别胶质瘤的临床特点和治疗 J 中华神经外科杂志，2020，36(2):146 150 2Liu ZZ，Tian YF，Wu H，et al LncRNA H19 promotes gliomaangiogenesisthroughmiR-138/HIF-1/VEGFaxis J Neoplasma，2020，67(1):111 118 3Chen YK，Yen Y The ambivalent role of lncRNA Xist incarcinogenesis J Stem Cell Rev Rep，2019，15(2):314 323 4Cheng ZH，Luo C，Guo ZL LncRNA-XIST/microRNA-126 spongemediates cell proliferation and glucose metabolism through theIRS1/PI3K/Akt pathway in gliomaJ J Cell Biochem，2020，121(3):2170 2183 5Zhang Y，An JY，Pei YC LncRNA SNHG6 promotes LMO3expression by sponging miR-543 in glioma J Mol Cell Biochem，2020，472(1 2):9 17 6赵念念，冯榕，张丽，等 LncRNA/hnRNP 在调控基因表达中的机制及功能J 生命的化学，2020，40(10):1815 1824 7Xu LG，Huan L，Guo TA，et al LncRNA SNHG11 facilitates tumormetastasis by interacting withand 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