DB 5304∕T 001-2019 草莓脱毒瓶苗生产技术规范(玉溪市).pdf

ICS 65.020.20 B 39 DB5304 玉溪市地方标准 DB 5304/T 0012019 DG5304/T 001-2015 草莓脱毒瓶苗生产技术规范 2019 11 25 发布 2020 02 24 实施 玉溪市市场监督管理局 发 布 DB5304/0012019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规定起草。本标准的附录 A 为资料性附录。本标准由玉溪市农业农村局归口。本标准起草单位：玉溪市农业科学院。本标准主要起草人：张军云、张钟、李晓亮、王文智、杨世先、张建康、张翠萍、陈桂芬、段永华、龚跃华、邓成忠、廖凯。DB5304/0012019 1 草莓脱毒瓶苗生产技术规范 1 范围 本标准规定了草莓脱毒瓶苗生产的术语和定义、组培工厂的设计要求和所需仪器设备及化学试剂、培养基的配制、消毒灭菌操作、接种操作、培养室操作、组培苗生产流程和脱毒瓶苗出苗标准等。本标准适用于玉溪市草莓脱毒瓶苗生产。2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。2.1 植物组培 植物组织培养的简称，在无菌条件下，将离体的植物器官（如根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（如形成层、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）或原生质体等，培养在人工配制的培养基上，在一定的光照和温度条件下，使之生长、分化并发育成完整小植株的培养技术。2.2 草莓茎尖脱毒组培技术 根据植物病毒在植物体内分布的不均性，越接近茎尖生长点（约 0.11 毫米区域），病毒浓度越稀或接近无病毒的原理，采用草莓茎尖处较小的生长点通过离体植物组织培养达到脱除植物病毒的技术。2.3 组培苗（瓶苗）经植物组织培养获得的根茎叶齐全的瓶装生根苗。2.4 组培室 采用植物组织培养技术，生产植物组培苗的车间。2.5 外植体 指用于植物组织培养的植物体或一部分器官、组织、细胞及细胞器。2.6 DB5304/T 0012019 2 植物激素 调节植物生长发育的物质，对植物的生长、发育、衰老、休眠、抗逆性具有极其重要的作用，组织培养常用的植物激素有生长素、细胞分裂素。2.7 培养基 在植物组织培养过程中，根据不同植物营养所需求，由人工配制的提供培养材料生长所必需的营养元素和某些植物生长物质的基质。2.8 培养材料 生长在培养容器中的培养基上的无菌植物材料。2.9 接种 将灭菌后的外植体或培养材料在无菌条件下接入培养容器内培养基中的过程。2.10 初代培养 指将灭菌后的外植体接种在无菌培养基中获得无菌材料和无性繁殖系前的最初几代培养。2.11 诱导培养 将灭菌后的外植体或培养材料接种到培养基中进行培养使其生长发育的过程。2.12 继代培养 培养过程中将培养材料周期性地分株、分割、剪截等操作后转接入新鲜培养基中继续培养的过程。2.13 增殖培养 继代培养材料产生出不定芽或新的组培苗的过程。2.14 培养代数 同一培养材料经继代培养的次数。2.15 繁殖倍数 DB5304/0012019 3 一个培养周期内不定芽增殖倍数，即培养一个周期后增殖的不定芽数/接种时的不定芽数。2.16 生根培养 把不定芽转移到生根诱导培养基中诱导生根，形成完整植株的过程。2.17 组培室 进行植物组织培养技术研究和组培苗生产的场所，包括洗涤室，培养基配制室，灭菌室，接种室和培养室等部分。2.18 洗涤室 洗涤各种玻璃器皿、培养瓶和各种用具以及进行植物材料预处理的场所。2.19 培养基配制室 配制化学试剂、培养基母液、培养基以及分装培养基和蒸馏水等的场所。2.20 灭菌室 进行培养基、无菌水和器械等高压灭菌的场所。2.21 接种室 接种室也称无菌操作室，是外植体的灭菌、培养材料的接种、转移、继代增殖、生根等无菌操作工作的场所。2.22 培养室 培养材料和组培苗在人工控制温度、相对湿度和光照等条件下培养和生长的场所。3 组培工厂的设计要求、所需仪器设备及化学试剂 3.1 设计要求 3.1.1 组培工厂应建在排水设施良好，常年主风向的上风区。应远离各种污染源（如粉尘大的工厂、微生物工厂和繁忙交通干道），周边环境应干燥、安静、通风透光、空气清新。3.1.2 组培工厂设计包括组培车间：洗涤室、培养基配制室、灭菌室、接种室、培养室、办公室等。DB5304/T 0012019 4 3.1.3 新建组培工厂地基应高出地面 30 厘米以上，楼顶不应有渗漏；若建两层或三层，洗涤室、培养基配制室、灭菌室宜安排在楼下，接种室、培养室应防潮、隔热保温，宜安排在二楼、三楼。3.1.4 利用办公室、仓库等旧房进行改造的组培工厂，应合理安排，做到杜绝污染，方便工作，节省能源，使用安全。3.1.5 组培工厂各分区要布局合理，应根据生产工艺流程，把各部分安排成一条连续、有序和通畅的生产流水线。3.2 生产设备 3.2.1 洗涤设备 工厂化生产可选用自动或半自动洗瓶机或人工洗涤，配洗涤室水槽、塑料盆、塑料桶、塑料箱等。3.2.2 灭菌设备 高压蒸汽灭菌锅（大型卧式、中型立式、小型手提式）、器械消毒器、紫外灯、烘干箱、臭氧发生器、除湿器等。3.2.3 接种设备及工具 无菌超净工作台、镊子、剪刀、解剖刀、手术刀、酒精灯等。3.2.4 培养设备 培养容器（三角瓶、罐头瓶、专制塑料瓶、试管等）、培养架、空调、除湿机、光照培养箱等。3.2.5 实验设备 冰箱、蒸馏水器、电子天平、pH 试纸、温湿度表、盛装器皿（烧杯、试剂瓶等）、计量器皿（量筒、容量瓶、移液管等）以及其他实验室常用器具等。3.2.6 脱毒设备 体视显微镜、解剖镜、高倍显微镜、电热恒温水浴锅、光照培养箱等，有条件的还可购置显微照相设备、测微尺等。3.3 常用化学试剂 组培中常用的无机盐类、有机物类、植物生长物质、消毒剂等参见附录 A。4 培养基的配制 4.1 MS 基本培养基母液的配制 表1 MS 基本培养基的配制比例表 编 号 母液 成 分 规定量(mg/L)扩大 倍数 称取量（mg）母液 体积（ml）配制1升培养基吸取量定容 DB5304/0012019 5 1 大量元素 硝酸钾 KNO3 1900 10 19000 1000 100 硝酸铵 NH4NO3 1650 10 16500 硫酸镁 MgSO47H2O 370 10 3700 磷酸二氢钾 KH2PO4 170 10 1700 2 氯化钙 CaCl22H2O 440 10 4400 1000 100 3 微量元素 硫酸锰 MnSO44H2O 22.3 100 2230 1000 10 硫酸锌 ZnSO47H2O 8.6 100 860 硼酸 H3BO3 6.2 100 620 碘化钾 KI 0.83 100 83 钼酸钠 Na2MoO47H2O 0.25 100 25 硫酸铜 CuSO4.5H2O 0.025 100 2.5 氯化钴 CoCL2.6H2O 0.025 100 2.5 4 铁盐 乙二胺四乙酸二钠 Na2-EDTA 37.3 100 3730 1000 10 硫酸亚铁 FeSO4.7H2O 27.8 100 2780 5 有机物 甘氨酸 C2H5NO2 2.0 100 100 500 10 盐酸吡哆醇 VB6 0.5 100 25 盐酸硫铵素 VB1 0.1 100 5 烟酸 C6H5NO2 0.5 100 25 6 肌醇 C6H12O6 100 100 5000 500 10 4.2 植物激素的母液配制 细胞分裂素 6-BA：先用少量 0.1mol/L 的盐酸（HCl）溶解，然后加蒸馏水定容，配成浓度为 0.20.4 mg/ml 的母液。生长素 NAA：先用少量 0.1mol/L 的 KOH 或 NaOH 溶解，然后加蒸馏水定容，配成浓度为 0.01 mg/ml 的母液。母液保存于 4左右的冰箱内，保存不超过 15 天；母液容器上应贴好标签，注明名称、配制日期，发现标签不明或母液中有沉淀、浑浊或变色现象应停止使用。4.3 培养基配制 4.3.1 按配制培养基的量，称取所需要量的蔗糖、琼脂，量取所需量的基本培养基母液和植物激素母液。4.3.2 定容：加水定容，并充分搅拌均匀。DB5304/T 0012019 6 4.3.3 调节 pH：用 pH 计或 pH 试纸测 pH 值，用 0.1 mol/L 的 HCl 或 0.1 mol/L 的 NaOH 调节 pH 至要求值 5.86.0。4.3.4 分装：按照 30 ml/瓶进行分装。4.3.5 封口：盖好瓶盖，瓶盖外封一层报纸或白布，并用绳扎紧报纸或白布。5 消毒灭菌操作 5.1 高压蒸汽灭菌锅使用 5.1.1 组培中主要采用高压蒸汽灭菌器进行湿热灭菌，高压灭菌器适用于培养基（不耐高温的成分除外）、无菌水、玻璃器皿、金属器械等，以及污染瓶的灭菌处理。5.1.2 应严格按使用说明书操作各种类型的高压灭菌器。5.2 培养基灭菌 5.2.1 将封好口的培养基整齐放入高压灭菌锅内，盖紧盖，打开放气阀，加热排尽冷空气，关上放气阀，继续加热待压力表指针达到 1.1 kg/cm2 时开始计时，通常在压力 1.1 kg/cm21.2 kg/cm2 下，温度 121下灭菌 2030 分钟，时间到关闭电源自然冷却到压力表为 0 方可取出培养基。5.2.2 灭菌后的培养基应冷却，待完全凝固后再用。5.2.3 已灭菌的培养基不得与未灭菌培养基混放；灭菌后的培养基应注明培养基编号及配制日期。按培养基种类和配制先后分门别类储存于培养基储藏室内。为保证培养基质量，宜将配制好的培养基放置 5 天左右再用，且贮存时间不应超过一个月。5.3 其它材料灭菌 无菌水、玻璃器皿、接种器灭菌方法同培养基灭菌。接种器械用棉布或纸包好。5.4 灼烧灭菌 5.4.1 灼烧灭菌可采用接种用电热灭菌器或用酒精灯灼烧灭菌。5.4.2 用于超净工作台操作的镊子、手术刀、解剖刀等器械采用灼烧灭菌。5.5 擦拭、喷雾灭菌 5.5.1 物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如超净工作台台面、墙面、双手、植物材料表面等。5.5.2 擦拭、喷雾灭菌可用 75%的酒精。5.6 紫外线、臭氧灭菌 5.6.1 在接种室、培养室等房间定期用紫外灯、臭氧灭菌。5.6.2 灭菌一般为 30 分钟。5.7 熏蒸灭菌 5.7.1 接种室和培养室定期(一般 1 年 1 次2 次)用高锰酸钾及甲醛混合熏蒸。5.7.2 熏蒸时，房间关闭紧密，用甲醛（10 ml/m）和高锰酸钾（KMnO4，5g/m）熏蒸 2 3 天，通风无味后（一般需 23 天）人员方可进入。6 接种操作 DB5304/0012019 7 6.1 操作准备 6.1.1 接种操作前应将接种室的空调、超净工作台、接种用电热灭菌器、操作间及缓冲间的紫外灯开启，一般灭杀菌 30 分钟，雨季时还应开启除湿机降湿。6.1.2 接种人员洗手后，用 75%酒精擦手，在缓冲间更换拖鞋、穿白大褂（或接种服），戴上帽、口罩后进入接种室。6.1.3 接种人员在接种之前先准备酒精灯或电热灭菌器、酒精、无菌脱脂棉或纱布以及接种器械、培养基、接种用苗等。6.1.4 接种前用 75%酒精仔细擦超净工作台一遍。6.1.5 将接种用镊子、手术刀、解剖刀等器械从布包里取出，先用 75%酒精擦拭，再插入接种用电热灭菌器中进行灭菌，150250灭菌 30 秒以上，冷却备用。6.2 提取母瓶 6.2.1 母瓶预处理：按生产计划提取母瓶，表面喷 75%的酒精后，用无菌纱布擦净，放于操作台旁备用，6.2.2 母瓶检查：提取母瓶时要仔细检查母瓶是否污染，若发现污染母瓶应立即剔除。6.2.3 污染母瓶处理：把污染母瓶放于统一地点供集中处理。6.3 无菌牛皮纸的取放 打开密封牛皮纸的塑料袋，将报纸包着的牛皮纸放在超净工作台面上，用无菌镊子将报纸向上一层打开，漏出牛皮纸，应注意手不能接触报纸和牛皮纸的边沿，放在离风窗 1020 厘米处备用。6.4 接种 6.4.1 在接种之前，工作人员的手部，包括手腕，都要用 75%的酒精仔细擦拭一遍。6.4.2 先打开培养瓶盖，瓶口不要斜向外，用镊子小心将丛生芽取出整齐放于无菌的牛皮纸上；一次取苗不宜太多，以免风干。6.4.3 切苗：小心将草莓丛生芽用手术刀分成具有 3-5 个芽的小丛，待所有丛生芽切完后接种装瓶。接种操作过程中，手术刀和镊子都要在无菌牛皮纸斜上方操作，不应在其正上方操作。6.4.4 接苗：打开培养瓶盖，瓶盖和瓶同时握于一手，另一手用镊子取苗接种，250 mL 的培养瓶每瓶内接种 5 个小丛芽，生根培养接种数量为 10 株/瓶，丛芽或无根苗在瓶内要排放均匀、整齐；接种深度以丛芽或无根苗不倒为准，接种完后盖紧瓶盖。接苗时，镊子不应碰到培养瓶外壁或瓶口。6.4.5 切苗过程中产生的废弃物可堆放在无菌的牛皮纸内的一侧，不应散到牛皮纸外。6.4.6 切割和接种后，将接种器械在盛有 75%酒精的瓶中漂洗其上的琼脂、碎叶或碎根；或接种器械用 75%酒精浸湿的纱布擦净；插入电热灭菌器中灭菌后冷却备用。6.5 封口 全部接种操作完后统一将瓶盖边缘用酒精浸泡过的保鲜膜密封。6.6 记录 接种人员将品种代号、个人编号认真标示到瓶上，并将母瓶量、接种量、代数、接种日期等信息登记在专用记录本；6.7 送苗 DB5304/T 0012019 8 接种完毕，把瓶苗送到培养室，宜整齐摆放在指定的组培架上。6.8 关机 关闭电热灭菌器，把超净工作台收拾干净，清理接种过程中产生的空瓶、垃圾及杂物，擦拭操作台面，并用 75%酒精喷洒台面，台上的物品也宜摆放整齐；最后关闭超净工作台及电源。6.9 接种人员的注意事项 6.9.1 7.9.1 操作人员应注意个人整洁，勤剪指甲，操作时头、胳膊等不应进入超净工作台内。6.9.2 7.9.2 操作时不应随意谈话、说笑，以减少污染。6.9.3 7.9.3 工作人员出入应随手关门。6.9.4 7.9.4 工作过程中所产生的垃圾应及时清理。6.10 接种操作的安全管理 镊子、解剖刀、手术刀等接种器械的灭菌采用酒精擦拭或浸泡后在酒精灯上烧烤的方法进行，接种器械烧烤时应远离盛酒精的容器，不应烧烤后立即插入盛酒精的容器中，也应避免碰倒酒精容器或酒精灯后引起失火。在酒精灯点燃后，不可用酒精溶液喷洒超净工作台。万一失火，应立刻关闭电源，用湿布扑灭；若火势较大，用灭火器扑灭。7 培养室操作 7.1 培养室培养条件调控 培养室的温度一般控制在 23 2，相对湿度 30%45%（雨季时，开启除湿机降湿），光照强度 2000 Lx3000 Lx，以每天 10 h12 h 为宜，每天早上、中午、下午各检查一次并做好记录。7.2 培养瓶摆放 培养室内，培养瓶宜摆放整齐，品种应分明。7.3 污染检查 7.3.1 接种材料污染采取培养室管理员和接种员双重鉴别制，各自做好记录。7.3.2 所有污染材料不应在培养室、接种室及中央走廊内开启瓶盖。7.3.3 所有污染材料（包括真菌和细菌污染）应在发现当天经高压消毒灭菌后，送到洗涤室。7.3.4 对处理情况进行数据记录和简要分析原因，并反馈给操作人员。7.4 工作人员注意事项 7.4.1 进入培养室应穿工作服，包括更换拖鞋、穿白大褂。7.4.2 在培养室内保持安静、密封、干净和干燥的环境。7.4.3 进出培养室时应及时关门。7.4.4 各种生产用品要按固定的位置排放整齐。7.4.5 工作过程中所产生的垃圾应及时清理。7.4.6 培养室内出苗、进苗后，应及时整理，保持室内清洁，每天用自来水拖 1 次2 次地面。7.4.7 设备维护：维护各种生产设备的正常使用，不正常应及时报告进行处理。7.5 培养室内清洁、消毒 DB5304/0012019 9 7.5.1 每周用 75%的酒精溶液作喷雾降尘处理。7.5.2 每周用消毒液（0.1%新洁尔灭）抹地板、门窗等。7.5.3 每隔一周用紫外灯或臭氧发生器消毒 30 分钟。7.5.4 如培养室有通风装置（如安装有换气扇等）的可用甲醛熏蒸，每年 1 次2 次。7.5.5 每月用杀螨剂（克螨特、阿维菌素）、杀虫剂（吡虫啉、艾克敌）、杀蚂蚁药等药剂喷雾一次。7.5.6 定期检查培养室墙壁长霉情况，发现有霉菌时应及时清理，并用防菌涂料粉刷墙壁。8 组培苗生产流程 8.1 技术流程图 8.2 生产流程图 外植体（草莓匍匐茎）选择和采集 外植体消毒处理 茎尖剥离 初代培养 增 殖 培 养 高度在 1.5 厘米以上的小苗 丛芽 生根培养 病毒检测 无 病 毒 含病毒 淘汰 DB5304/T 0012019 10 8.3 外植体选择和采集 每年 35 月从母本园或田间选择健康、生长健壮的草莓植株，剪取草莓母株上生长充实而小叶尚未展开带有顶芽的匍匐茎（茎粗 24 毫米，长约 1015 厘米）,将匍匐茎装入塑料袋并密封，贴上标签记录品种名称、采集时间、采集地点和采集人员。将外植体迅速带回组培室处理，若没时间及时处理外植体，可将密封好的外植体放入冰箱 8冷藏 1，1 周之内必须处理。8.4 外植体消毒处理 剪取草莓匍匐茎顶端顶芽，先自来水冲洗 58 分钟，用洗衣粉水或洗洁精水浸泡 35 分钟并用自来水冲洗干净，40恒温水浴处理 4 小时；在超净工作台上用 70%酒精表面消毒 30 秒，再用 0.15%0.20%HgCl2消毒 45 分钟并不断搅动，最后无菌水冲洗 45 次。8.5 茎尖剥离 在双筒解剖镜（840 倍）下由外向内逐层剥去茎尖的幼叶,切取 0.20.5 毫米左右大小的茎尖生长点。8.6 初代培养 初代培养基为 MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.01 mg/L，蔗糖 3.0%，pH5.86.0。将剥离好的茎尖生长点接种于培养基，每瓶培养基接种 1 个生长点，培养时间 3060 天。8.7 病毒检测 随机抽取初代培养获得的无菌苗送往具有资质认定的植物病毒检测机构进行电镜负染色观察检测，达到脱毒效果（无病毒）的继续进行培养，否则及时淘汰。8.8 增殖培养 将初代培养诱导形成的幼芽（茎尖）或丛生芽或芽块（经检测无病毒），转接到增殖培养基中进行培养，培养时间 2030 天，增殖培养代数控制在 10 代以内。前期的增殖培养基为单独使用 MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.01 mg/L、或为 MS+6-BA0.8 mg/L+NAA0.01 mg/L 和 MS+6-BA0.4 mg/L+NAA0.01 mg/L 两培养瓶清洗、晾干 培养基配制、分装、灭菌 外植体准备 接种室接种 生根培养 培养室增殖培养 DB5304/0012019 11 个培养基交替使用，最后两代的增殖培养基为 MS+6-BA0.4 mg/L+NAA0.01 mg/L，蔗糖和 pH 均分别为 3.0%、5.86.0，增殖培养基的硬度稍微软点。前期增殖时每瓶接入 45 个芽（茎尖）或丛生芽或芽块，后期增殖时丛芽满瓶装。8.9 生根培养 10 月将具备单株个体形态、并且高度在 1.5 厘米以上的无根小苗按高度分级接种于生根培养基中，每瓶 10 棵装，小苗之外的丛芽接种入增殖培养基中继续增殖。小苗培养 2535 天即可长成根系发达（生根率达 100%），根、茎、叶健全的植株。生根培养基为 MS 培养基，蔗糖 3.0%，pH5.86.0。9 脱毒瓶苗出苗标准 经过2535天的生根培养，可以形成以下三个级别的脱毒瓶苗。表 2 草莓脱毒瓶苗分级标准 级别 根数（条）叶片数（片）苗高（厘米）其它 一级 5 条以上 6 片以上 2.5-5.0 根白色，短而粗壮，微有须根 二级 3-4 4-8 2.0-5.0 根微黄，稍长较细 三级 1-2 4-6 片 1.5-4.5 根细长，无须根 _ DB5304/T 0012019 12 A 附 录 A（资料性附录）草莓组培常用化学试剂、药品表 表A.1 大量元素 化 学 名 称 技术指标 包 装 单位 硝酸钾 AR 500g 瓶 硝酸铵 AR 500g 瓶 硝酸钙 AR 500g 瓶 硫酸铵 AR 500g 瓶 氢氧化钠 AR 500g 瓶 二水氯化钙 AR 500g 瓶 七水硫酸镁 AR 500g 瓶 磷酸二氢钾 AR 500g 瓶 磷酸二氢钠 AR 500g 瓶 过硫酸铵 AR 500g 瓶 过磷酸钙 AR 500g 瓶 表A.2 微量元素类 化学名称 技术指标 包装 单位 乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）AR 250g 瓶 乙二胺四乙酸铁钠（EDTA-FeNa）CP 250g 瓶 硫酸亚铁 AR 500g 瓶 硫酸锰 AR 500g 瓶 硫酸锌 AR 500g 瓶 硼酸 AR 500g 瓶 碘化钾 AR 500g 瓶 钼酸钠 AR 500g 瓶 氯化钴 AR 100g 瓶 硫酸铜 AR 500g 瓶 DB5304/0012019 13 表A.3 维生素类 化学名称 技术指标 包装 单位 肌醇 环己六醇 99%500g 瓶 盐酸硫胺（素）VB1 99%25g 瓶 烟酸（尼克酸）VB3 99%100g 瓶 D-泛酸钙 VB5 99%25g 瓶 维生素 B12 VB12 99%1g 瓶 表A.4 有机物类 化学名称 技术指标 包装 单位 甘氨酸 99%100g 瓶 蔗糖 AR 500g 瓶 表A.5 植物激素类 产 品 名 称 技术指标 包 装 单 位 6-苄氨基嘌呤 6-BA 99%10g 瓶 3-吲哚丁酸 IBA 99%10g 瓶 3-吲哚乙酸 IAA 99%10g 瓶 6-糠氨基嘌呤 激动素 KT 99%10g 瓶-萘乙酸 NAA 99%50g 瓶 表A.6 消毒试剂 化学名称 规格 单位 新洁尔灭 5%苯扎溴铵溶液 500mL 瓶 无水乙醇 AR 500mL 瓶 95%乙醇 医用 95%500mL 瓶 次氯酸钠 AR，500ml 瓶 甲醛 AR，500ml 瓶 高锰酸钾 AR，500g 瓶 升汞 AR，250g 瓶 吐温 80 AR，500ml 瓶 _