SN∕T 5332-2021 国境口岸恙虫病东方体实时荧光PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 53322021国境口岸恙虫病东方体实时荧光PCR 检测方法Detection of Orientia tsutsugamushi by real-time PCR at frontier ports2021-06-18 发布2022-01-01 实施ICS 11.020CCS C 62中华人民共和国海关总署发 布SN/T 53322021I前 言本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草的规定起草。本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国大连海关。本文件主要起草人：高玉峰、邹玉梅、孙赟、程晓兰、宋锋林。1SN/T 53322021国境口岸恙虫病东方体实时荧光 PCR 检测方法1范围本文件规定了国境口岸恙虫病东方体的检测对象、生物安全要求、样品采集及保存运输、检测方法和结果判断等。本文件适用于国境口岸恙虫病东方体的实时荧光 PCR 检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489 实验室 生物安全通用要求SN/T 1240 国境口岸鼠类监测规程SN/T 4271.3 国际航行船舶携带医学媒介生物采集方法 第 3 部分：鼠类WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用WS 233 病原微生物实验室生物安全通用准则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 恙虫病东方体 Orientia tsutsugamushi变形菌纲 亚群立克次体目立克次体科东方体属，为恙虫病病原体，革兰氏染色阴性，常见球杆菌状或短杆菌状，多成对分布似双球菌状，0.3 m0.5 m*0.8 m2.0 m。3.2 Ct 值 threshold cycle以实时荧光 PCR 反应前 3 个 15 个循环之间的基线荧光信号标准差的 10 倍作为荧光阈值，实时荧光扩增产生的荧光信号达到阈值时对应的循环数为阈值循环数。3.3 小沟结合体 minor groove binder一种荧光淬灭基团。4缩略语下列缩略语适用于本文件。PCR：聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction；DNA：脱氧核糖核酸 Deoxyribonucleic Acid；2SN/T 53322021MGB：小沟结合体 Minor Groove Binder。5检测对象本文件检测对象包括：国境口岸及出入境交通工具、集装箱、货物、行李等场所采集的鼠类样品；国境口岸疑似恙虫病患者的临床样品。6生物安全要求及防污染要求生物安全应遵循 GB 19489 和 WS 233 中相关规定，本方法中恙虫病东方体实时荧光 PCR 检测应在生物安全 2 级（BSL-2）实验室内进行；PCR 防污染要求应遵循 WS/T 230 中相关规定。7主要仪器与试剂7.1 主要仪器本文件中主要仪器设备如下：高速冷冻离心机；高压蒸汽灭菌锅；实时荧光定量 PCR 仪；生物安全柜；组织研磨仪；普通冰箱（4）；冷冻冰箱（-20）；超低温冰箱（-70）；微量可调移液器（2 L、10 L、200 L 及 1 000 L 等）；水浴锅或金属浴。7.2 主要试剂本文件中使用的主要试剂如下：市售商品化基因组提取试剂盒；2 Premix Ex Taq1）a；引物：Ot-F 及 Ot-R；探针：Probe-O；双蒸水（ddH2O）。8样品的采集和保存运输8.1 鼠类样品按照 SN/T 1240、SN/T 4271.3 进行鼠类样品采集、保存和运输。1）2 Premix Ex Taq 是由 TaKaRa 公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不是表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。3SN/T 533220218.2 临床样品无菌采集疑似恙虫病患者静脉血 3 mL5 mL(EDTA 抗凝)，低温（4 8）运输至实验室检测。如在 24 h 内检测，置于 4 8 冰箱保存；否则，置于-20 及以下冰箱冻存待检。9检验方法9.1DNA 提取按基因组提取试剂盒说明书中相关操作步骤对鼠类肺脏等脏器组织样品、疑似恙虫病患者全血样品进行核酸提取。9.2 引物及探针引物和探针参照恙虫病东方体 Karp、Gilliam 及 Kato 血清型 56-kDa 蛋白基因序列设计，扩增片段大小为 130 bp，序列如下：Ot-F：5-TCTRCRCCAGTAATYATTCCTCC-3 R=A/G Y=T/COt-R：5-TGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGC-3Probe-O：5-FAM-AAGGACCACACTCTAAT-MGB-3引物及探针合成后用 ddH2O 溶解并分装冻存于-20 冰箱内，探针置于避光管中，避免反复冻融。引物及探针工作液浓度为 10 M。注：可采用市售商品化试剂盒进行恙虫病东方体检测和结果判断。9.3实时荧光 PCR9.3.1对照的设立在核酸扩增实验中应同时按下列所述设置阳性对照、阴性对照及空白对照。阳性对照：以构建的恙虫病东方体质粒 DNA 作为阳性对照（见附录 A）。阴性对照：以未感染恙虫病东方体的样品 DNA 作为阴性对照。空白对照：以 ddH2O 作为空白对照。9.3.2实时荧光 PCR 反应9.3.2.1 反应体系实时荧光 PCR 反应总体系 20 L，组成见表 1。表 1 实时荧光 PCR 反应体系组分使用量（L）2 Premix Ex Taq10Ot-F(10 M)0.6Ot-R(10 M)0.6Probe-O(10 M)0.6ddH2O5.2模板 DNA34SN/T 533220219.3.2.2 反应条件以 LightCycler 480I 型1)实时荧光定量 PCR 仪器为例，反应条件如下：50，2 min；95，10 min；95，15 s；60，1 min；循环 45 次，退火时收集荧光信号。荧光通道为 FAM。注：由于不同实时荧光定量 PCR 仪性能有差异，可根据实际仪器型号，对检测程序略做调整。9.4 结果判断与报告9.4.1 质量控制有效实验应同时满足以下条件：阳性对照有扩增曲线，且 Ct 值 35；阴性对照及空白对照无 Ct 值，或 Ct 值 40，且无扩增曲线。9.4.2 阴性结果在有效实验条件下，待检样品 Ct 值 40，且无典型扩增曲线，判为阴性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阴性（实时荧光 PCR 法）。9.4.3 阳性结果在有效实验条件下，阳性结果判断及报告如下：待检样品 Ct 值 35，且出现典型扩增曲线，判为阳性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阳性（实时荧光 PCR 法）；如待检样品 35 Ct 值 40，且出现典型扩增曲线，需要复检，复检后 Ct 值仍在 3540 之间，且出现典型扩增曲线，判为阳性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阳性（实时荧光PCR 法）。否则判为阴性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阴性（实时荧光 PCR 法）；如待检样品 40 Ct 值 45，且出现扩增曲线，建议采用浓缩方式处理核酸样品后复检，复检后 Ct 值有明显减小趋势，且扩增曲线有典型对数增长期，判为阳性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阳性（实时荧光 PCR 法），此类样品建议采用其他检测方法进行确认。否则判为阴性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阴性（实时荧光 PCR 法）。1)是适合的市售产品的实例，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。如果其他等 效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。5SN/T 53322021附录A（规范性）阳性对照样品制备A.1质粒构建构建恙虫病东方体阳性质粒，核酸序列如下：GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG。A.2对照品稀释对质粒样品进行适当稀释，当检测 Ct 值在 2035 之间，进行分装，置于-20 冰箱中保存备用。中华人民共和国出入境检验检疫开本 8801230 1/16 印张 0.75 字数 16 千字2021 年 7 月第一版 2021 年 7 月第一次印刷印数 1500书号：155175359 定价 14.00 元国境口岸恙虫病东方体实时荧光PCR 检测方法行 业 标 准SN/T 53322021*SN/T 00002019北京市朝阳区东四环南路甲 1 号（100023）编辑部：[phone]-7531中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行网址