麸炒白术水提液对实验性功能...Cl--、K-+转运的影响_张敏.pdf

中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 593 论著通信作者：唐旭东，北京市东城区东直门内南小街16号中国中医科学院，邮编：100700，电话：[phone]，E-mail：麸炒白术水提液对实验性功能性腹泻脾虚证 大鼠结肠上皮Cl-、K+转运的影响张敏1，王凤云1，唐旭东2，薛红1，马金鑫3（1中国中医科学院西苑医院，北京 100091；2中国中医科学院，北京 100700；3北京大学医学部，北京 100191）摘要：目的：观察实验性功能性腹泻（FDr）脾虚证大鼠黏膜上皮离子转运的情况，及白术水提液对其上皮离子转运的影响途径。方法：将Wistar大鼠随机分为正常组和模型组，采用高乳糖饲料喂养叠加小平台站立的复合因素的方法造模，通过体外应用尤斯灌流装置，观察正常组和模型组大鼠的短路电流变化和白术水提液对大鼠远端结肠上皮离子转运所产生的短路电流的作用机制。结果：正常组与模型组的基础电生理特性没有显著性差异；60 mg/mL白术水提液能够引起两组大鼠黏膜上皮短路电流显著下降（P0.05），分别加入Na+通道阻断剂amiloride、Cl-/HCO3-交换体抑制剂DIDS后，两组大鼠的短路电流没有明显改变；采用非选择性Cl-、K+通道阻断剂，Na+-K+-2Cl-转运体抑制剂DPC、TEA、bumetanide后，两组大鼠的短路电流均显著受到抑制（P0.05）；在无Cl-、无Cl-/HCO3-的KHS中，白术水提液引起的短路电流均减小（P0.05），但在无HCO3-的KHS液中，短路电流差异无统计学意义。结论：白术水提液对FDr大鼠上皮离子转运的影响是通过调控顶膜侧上的Cl-通道、K+通道及基底膜侧Na+-K+-2Cl-转运体，影响Cl-的吸收、K+的分泌，从而调节结肠上皮的水和电解质的平衡。关键词：白术；功能性腹泻；离子转运；吸收分泌；短路电流基金资助：国家自然科学基金重点项目（No.81830118），国家自然科学基金面上项目（No.81873297），中国中医科学院中医药科技重大成果引导项目（No.ZZ13-ZD-02）Effects of Atractylodes macrocephala aqueous extract on colonic epithelial Cl-and K+ion transport in rats with experimental functional diarrhea in spleen deficiency syndromeZHANG Min1,WANG Feng-yun1,TANG Xu-dong2,XUE Hong1,MA Jin-xin3(1Xiyuan Hospital,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100091,China;2China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;3Peking University Health Science Center,Beijing 100191,China)Abstract:Objective:To investigate the changes of mucosal epithelial ion transport in rats with functional diarrhea(FDr)spleen deficiency syndrome and the effect of Atractylodes macrocephala aqueous extract on its epithelial ion transport.Methods:The Wistar rats were randomly divided into a normal group and model group.The rat model was made by feeding high lactose feed with compound factors superimposed on small platform.Using Ussing chamber device in vitro,the changes of short-circuit current(Isc)in normal group and model group and the effect of Atractylodes macrocephala aqueous extract on ion transport in distal colonic epithelium of the two groups were observed.Results:There was no significant difference in basic electrophysiological characteristics between normal group and model group.The aqueous extract of Atractylodes macrocephala 60 mg/mL could significantly reduce the short-circuit current of mucosal epithelium in the two groups(P0.05).After adding Na+channel blocker,Cl-/HCO3-exchanger inhibitor amiloride and DIDS respectively,there was no significant change in Isc in the two groups.After using non selective Cl-,K+channel blockers,Na+-K+-2Cl-transporter inhibitors DPC,tea and bumetanide,the Isc of the two groups was significantly inhibited(P0.05);After replacing Cl-,Cl-/HCO3-from KHS solution,the Isc induced by Atractylodes macrocephala aqueous extract decreased(P0.05),but there was no significant difference in Isc after 内文1.indd 5932023/2/10 16:57:12中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 594 replacing HCO3-from KHS solution.Conclusion:The effect of Atractylodes macrocephala aqueous extract on epithelial ion transport in and FDr rats may be through regulating Cl-channel,K+channel on parietal membrane and Na+-K+-2Cl-transporter on basement membrane,affecting Cl-absorption,K+secretion,so as to restore the banlance of water and electrolyte transport of colonic epithelium.Key words:Atractylodes macrocephala;Functional diarrhea;Ion transport;Absorption secretion;Short-circuit currentFunding:Key Program of National Natural Science Foundation of China(No.81830118),General Program of National Natural Science Foundation of China(No.81873297),Guided Program of Major Achievement in Science and Technology of Traditional Chinese Medicine of China Academy of Chinese Medical Sciences(No.ZZ13-ZD-02)功能性腹泻（funtional diarrhea，FDr）是指持续反复出现稀粪（糊状粪）或水样粪，不伴有腹痛或腹部不适症状的综合征1。胃肠动力异常、内脏高敏感、胃肠电生理紊乱、肠道微生态紊乱、胃肠激素分泌异常、遗传与环境因素、心理因素等2-3都可以导致疾病的发生，FDr虽然发病机制复杂，但最终都会导致肠道水电解质分泌和吸收的紊乱4-5，引起机体内外环境平衡的变化。目前，大部分的研究没有将FDr与肠易激综合征严格区分开，与肠易激综合征的发病机制研究相比，对于FDr的机制研究相对较少，仍需要研究者进一步深入探讨。在此基础上，本研究旨通过尤斯灌流装置，利用体外实验探讨白术水提液对FDr脾虚证大鼠结肠上皮离子转运的 作用。材料1.动物 SPF级雄性Wistar大鼠60只，89周龄，体质量220 g，由北京斯贝福实验动物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2018-0010。饲养条件：温度（232），湿度（655）%，12 h/12 h光暗循环（照明时间为8：00至20：00），自由饮食，所有动物实验程序均按照中国和国际指南和规定 进行。由中国中医科学院西苑医院伦理委员会（批号：No.2020XLA062-2）。2.药物与试剂 麸炒白术水提液（以下简称白术水提液），由中国中医科学院西苑医院药剂科制作，生药量为0.5 g/mL。阿米洛利（amiloride）（批号：101397945）、N,N-二甲基哌啶氯化物（DPC）（批号：10420372）、四乙基胺（TEA）（批号：78203474）、布美他尼（bumetanide）（批号：101532860）、4,4-二异硫氰酸基-2,2-二苯乙烯磺酸二钠（DIDS）（批号：1001958697）、NaCl（批号：101873395）、NaHCO3（批号：101386773）、KCl（批号：101872277）、MgCl2（批号：101440787）、KH2PO4（批号：101516358）、CaCl2（批号：101387197）、Glucose（批号：101516359）、Na-gluconate（批号：101863140）、K-gluconate（批号：1002472050）、MgSO4（批号：101440787）、Ca-gluconate（批号：1002312902），以上试剂均购自Sigma。50%高乳糖饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，合格证号：SCXK（京）2009-0012。3.仪器 尤斯灌流装置：VCC MC6型多道电压-电流钳装置（Physiologic Instruments公司）、Power Lab数据采系统（Physiologic Instruments公司）、HWS-24型电热恒温水浴槽（上海一恒）、TYXH-型漩涡混匀器（天悦电子）、PHBJ-260型手持式pH仪（上海仪电）。方法1.造模方法与分组 按随机数表法将60只Wistar大鼠分为正常组和模型组，每组30只。用50%高乳糖饲料喂养模型组大鼠14 d，同时每日18：00至次日8：00将大鼠放在制作的小平台站立箱中。正常组常规喂养。2.溶液配制 Krebs-Henseleit液（KHS）的组成：NaCl 117 mmol/L，NaHCO3 24.8 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，MgCl2 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，CaCl2 2.56 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L。无Cl-的KHS的组成：Na-gluconate 117 mmol/L，NaHCO3 24.8 mmol/L，K-gluconate 4.7 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，Ca-gluconate 2.56 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L。无HCO3-的KHS的组成：Na-gluconate 141.8 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，MgCl2 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，CaCl2 2.56 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L。无Cl-/HCO3-的KHS的组成：Na-gluconate 141.8 mmol/L，K-gluconate 4.7 mmol/L，MgSO4 1.2 mmol/L，KH2PO4 1.2mmol/L，Ca-gluconate 2.56 mmol/L，Glucose 11.1 mmol/L。配制好的溶液通入5%CO2和95%O2的气体，加入HEPES使pH值维持在7.4，放置到4 冰箱保存。3.组织制备 大鼠CO2安乐箱处死后，迅速取出远端结肠，放入KHS中，取1 cm的肠段，沿肠系膜剪内文1.indd 5942023/2/10 16:57:12中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 595 开，将组织冲洗干净，然后将黏膜面朝下固定在铺有Sylgard 184硅胶的培养皿上，器皿中盛有通入混合气的KHS。用精细镊子，在显微镜下将浆膜层、肌层和黏膜下层与黏膜层钝性分离。每只大鼠可制备3块标本。4.短路电流（short-circuit current，Isc）的 测量 本研究采用恒温尤斯灌流装置体外测量Isc。将结肠黏膜置于灌流装置的Ussing小室中，黏膜标本垂直置于左、右两半室之间开口处，连接Ag/AgCl琼脂电极，在结肠黏膜的两侧注入5 mL KHS，同时通入95%O2和5%CO2的混合气，使溶液pH值维持在7.4左右，连通37 水浴60 min，使其电参数达到稳定，将跨上皮层的电压钳制到0，开始进行记录：测量各组大鼠结肠黏膜基础状态下的跨膜电流、跨膜电阻；在基底膜分别加入使终浓度为10、20、40、60、80、100 mg/mL的白术水提液，观察Isc的变化；在结肠黏膜顶膜侧分别加入不同离子通道阻断剂（ENaC通道阻断剂amiloride 10 mmol/L、非选择性Cl-通道阻断剂DPC 5 mmol/L、K+通道阻断剂TEA 5 mmol/L）预处理后，测量白术水提液对各组大鼠Isc的影响；在基底膜侧分别加入Na+-K+-2Cl-共同转运体特异性阻断剂bumetanide 1 mmol/L和Cl-/HCO3-交换体抑制剂DIDS 100 mmol/L预处理，观察白术水提液对各组大鼠Isc的影响；分别将Cl-、HCO3-、Cl-和HCO3-从正常KHS中替换后，测量白术水提液对各组大鼠Isc的影响。5.统计学方法 数据分析采用SPSS 20.0软件，实验结果以x-s表示。所有数据均进行正态性检验和方差齐性检验，符合正态分布且方差齐性的数据通过单因素方差分析（One-way ANOVA）进行多样本间比较，对不服从正态分布或方差不齐的数据，采用非参数检验，以P0.05为差异有统计学意义。结果1.两组大鼠基础电生理特性 在离体状态下，正常组和模型组离体远端结肠黏膜生理状态下的基础跨膜电流为（14.350.43）和（14.770.49）mA/cm2，跨膜电阻为（21.573.22）和（25.103.56）/cm2。两组比较差异无统计学意义。2.不同浓度白术水提液对两组大鼠Isc的 影响 见图1。正常组和模型组大鼠的结肠黏膜Isc的变化呈剂量依赖性下降，变化幅度不断增大，但达到一定浓度后，变化幅度开始减小。其中，在60 mg/mL 时引起的Isc变化最大。图1 不同浓度白术水提液对Isc的影响（x-s）注：与本组给药前比较，*P0.05。图2同。给药量（mg/mL）正常组*模型组10-20-15-10-50Isc变化（A/cm2）408020601003.离子通道阻断剂和转运体抑制剂对白术水提液引起的Isc的影响 见图2。amiloride不影响白术水提液引起的Isc；而DPC、TEA能够显著抑制白术水提液引起的Isc（P0.05），但两组之间比较差异无统计学意义。在结肠黏膜上皮的基底膜侧分别加入Na+-K+-2Cl-/K+-Cl-共同转运体特异性阻断剂bumetanide、Cl-/HCO3-交换体抑制剂DIDS后，bumetanide能够显著抑制白术水提液引起的结肠黏膜上皮的Isc（P0.05），DIDS对白术水提液引起的结肠黏膜上皮的Isc基本没有影响，正常组与模型组比较差异无统计学意义。图2 离子通道阻断剂和共同转运体特异性阻断剂对白术 水提液引起的Isc的影响注：A.Isc图；B.统计分析（x-s）。正常组模型组Isc变化（A/cm2）Isc变化（A/cm2）白术白术*amiloride+白术amiloride+白术DPC+白术DPC+白术TEA+白术TEA+白术DIDS+白术DIDS+白术bumitanide+白术bumitanide+白术正常组正常组正常组正常组正常组模型组模型组模型组模型组模型组时间（s）时间（s）时间（s）时间（s）时间（s）Isc（A/cm2）Isc（A/cm2）Isc（A/cm2）Isc（A/cm2）Isc（A/cm2）白术白术白术白术白术TEADIDSbumetanideDPCamilorideBA4.离子替换液对白术水提液引起的Isc的影响 见图3。在无Cl-、无Cl-/HCO3-的KHS液中，两组Isc的变化内文1.indd 5952023/2/10 16:57:16中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 596 差异有统计学意义（P0.05）；在无HCO3-的KHS液中，Isc的变化差异无统计学意义。图3 无Cl-、无HCO3-、无Cl-/HCO3-的离子替换液对 白术水提液引起的Isc的影响（x-s）注：与KHS比较，*P0.05。Isc变化（A/cm2）Isc变化（A/cm2）*KHSKHS无Cl-的KHS无Cl-的KHS无HCO3-的KHS无HCO3-的KHS无Cl-/HCO3-的KHS无Cl-/HCO3-的KHS讨论FDr产生的最终环节是肠道水电解质分泌和吸收的紊乱，肠黏膜上皮细胞广泛分布于肠腔，它们之间通过紧密连接联系起来，经跨细胞通路和细胞旁通路，维持水、电解质和水溶性物质的吸收和分泌的平衡6。既往研究7认为，FDr取决于肠道离子通道转运的失调，以及肠道上皮细胞分泌和吸收功能之间的相关失衡，许多主要离子转运蛋白与腹泻疾病的发病机制有关。FDr归属于中医学“泄泻”的范畴，多由外邪犯胃、饮食劳倦、情志失调、素体虚弱等导致脾虚湿盛，脾胃运化功能失常，肠道分清泌浊、传导功能失司，因此多从健脾化湿的角度治疗。白术是菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根茎，味甘苦，性温，专入脾、胃二经，长于补气健脾、燥湿利水，炒制后健脾化湿之力增强，因此临床多用于治疗脾虚泄泻。目前在白术治疗腹泻的研究中发现，白术可以显著增加水通道蛋白（aquaporin，AQP）3和AQP8的表达，恢复异常的水液代谢8。以白术为主的复方研究也表明，通过调节大鼠远端结肠中ENAC-和ATP1A1的异常表达9，以及NHE3、GLUT2、SGLT1的表达10，起到缓解FDr发生的作用。这些结果均证明了白术调节离子转运的巨大潜力。因此，本研究旨从离子转运的角度，探讨白术对实验性FDr大鼠远端结肠黏膜上皮离子转运的影响，以及发挥止泻作用的途径。尤斯灌流装置被认为是研究离子转运的金标准，可以反映肠上皮药物吸收的机制、通透性、肠道微生物的作用及内毒素的移位等11-12。中药及其提取物能够直接调节上皮离子转运。有研究13-14表明，疏肝健脾方对腹泻型肠易激综合征大鼠治疗作用的发挥与大鼠结肠黏膜多巴胺、5-羟色胺通路相关的离子转运的调节作用有关，这一过程主要由结肠上皮Cl-通道，NA+-K+-2Cl-共转运体等膜通道蛋白共同介导。也有研究15表明，补中益气颗粒治疗慢性腹泻主要与调节Cl-的分泌有关，从而使肠道的水分减少。本研究中采用高乳糖饲料喂养叠加小平台站立的复合因素方法造模，成功复制了实验性FDr脾虚证大鼠模型。实验结果表明，正常组与模型组的基础电生理特性并没有显著性差异。白术水提液使正常组、模型组大鼠结肠黏膜上皮产生向下的电流曲线，说明白术水提液对大鼠的上皮细胞离子转运有直接的调节作用，根据Isc实验原理，向下的Isc曲线代表阴离子的吸收或者阳离子的分泌。因此本研究中，顶膜侧预先应用上皮Na+通道阻断剂amiloride阻断上皮对Na+的转运后，白术水提液引起的Isc反应并无明显改变，说明上皮Na+通道可能与白术水提液引起的离子转运并无密切关系，而在顶膜侧预先应用非选择性Cl-、K+通道阻断剂DPC、TEA阻断顶膜侧Cl-的吸收、K+的分泌后，两组Isc明显减少，说明白术水提液对FDr的治疗作用可能与影响Cl-的吸收、K+的分泌有关。在基底膜侧预先加入 NA+-K+-2Cl-共同转运体的阻断剂bumitanide后，白术水提液引起的Isc反应明显受到抑制，说明 NA+-K+-2Cl-共同转运体同样参与了大鼠结肠上皮转运活动的调节，但在基底膜侧预先加入Cl-/HCO3-交换体的抑制剂DIDS后，Isc反应并无明显变化，说明该通道未参与白术水提液调节的离子转运。此外，本研究将Cl-从正常KHS替换后，白术引起的Isc明显受到抑制，进一步证明白术对Cl-引起的上皮离子转运具有一定的调节作用。本研究发现白术水提液能够直接调节Cl-的分泌和K+的吸收。既往的理论中，Cl-分泌的失衡、K+吸收，都会导致腹泻症状的产生。众所周知，在正常情况下，Cl-转运是维持肠道电解质平衡的关键环节，Cl-通过NKCC介导进入基底外侧膜，并通过cAMP和Ca2+依赖性氯通道从顶端侧分泌到肠腔中，电解质被分泌到肠腔内，产生水的渗透驱动力16。K+不仅在维持细胞内外的水电解质平衡方面发挥着重要作用，而且还是维持细胞膜静息电位的物质基础，是影响神经肌肉组织兴奋性的重要因素17。白花丹素通过调节抑制CaCC和CFTR通道，可以缓解腹泻症状的内文1.indd 5962023/2/10 16:57:17中华中医药杂志(原中国医药学报)2023年2月第38卷第2期 CJTCMP,February 2023,Vol.38,No.2 597 发生18。而小檗碱可以抑制大鼠结肠上皮细胞基底膜钙依赖钾通道的开放19，这可能是中药发挥止泻作用的机制之一。综上所述，白术水提液对正常大鼠和实验性FDr大鼠上皮离子转运的影响主要是通过调控顶膜侧上的Cl-通道、K+通道及基底膜侧Na+-K+-2Cl-转运体，影响Cl-的吸收、K+的分泌，从而调节结肠上皮的水和电解质的平衡。参 考 文 献1 美德罗斯曼.罗马:功能性胃肠病第2卷.4版.柯美云,主审.方秀才,侯晓华,主译.北京:科学出版社,2016:653-6542 康楠,李家立,王凤云,等.中医药治疗功能性腹泻的研究进展.世界中医药,2015,10(7):998-10013 刘燕,白世敬,马捷,等.功能性腹泻中医研究进展.辽宁中医药大学学报,2015,17(2):78-804 Camilleri M,Sellin J H,Barrett K E.Pathophysiology,evaluation,and management of chronic watery 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