厌氧菌的分离培养与鉴定.pdf

厌氧菌的分离、培养与鉴定 定义侬有氧条件下不能生长，无氧条件（不是绝对）下才可以生 长的一类细菌。g 1836年 PcisWur 提出侬专性厌氧菌有氧不生长，原因有二：厌氧菌缺乏细胞色素与细胞色素氧化酶，因此不能氧化那些氧化 还原电势较高的氧化型物质。厌氧菌缺乏过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶，不能清除 有氧环境下所产生的超氧离子（。乃 和过氧化氢（电。2），因而 难以存活。分类3根据能否形成芽胞，可分为脆弱类杆菌（氏加g/S）：临床上最常见的无芽胞厌氧菌分离株需要了解的一些信息3常见厌氧菌的分类学。明确厌氧菌在人体各部位的正常菌群。各部位感染时可能分离出的厌氧菌种类3自己做的试验是否成功,指导临床正确采样和输送，最好亲自床边采样。可疑厌氧菌感染特征3感染局部生气体3分泌物有恶臭3分泌物带血或呈黑色3粘膜周围的感染，如肛周、口腔、鼻窦、咽颊等3细菌培养阴性，但有菌血症表现3长期使用氨基糖甘类抗生素，但无效者3有基础疾病免疫低下者几种主要厌氧菌的特征细菌血平皿上菌落形态镜下形态其他特征突起、灰白色、透明、折光微溶血G-杆菌、多形态、染色不均耐卡那霉素、胆汁促生长产黑色素类杆菌突起、桃红色荧光、白光下棕黑色、溶血小、末端圆型、常呈球型耐卡那霉素、触酶阳性、胆汁抑制生长核梭杆菌突起、闪光、斑点状、面包屑样斑点菌落、绿色溶血长梭状、二头尖细、有时呈纤维状卡那、青霉素3”、可被胆汁抑制、消化球菌小突起、灰白浑浊、边缘透明、可溶血或绿色溶血大小不等、可成单、成双、成堆成堆、液化明胶消化链球菌同上大小不等成对成链、形态较小产气荚膜梭菌微突起、微浑浊、灰色、边缘整齐或不规则。宽的双溶血环大、末端钝、芽胞极难形成无动力、液化明胶、发酵多种糖、水解七叶昔脆弱类杆菌B B E寒天培地脆弱类杆菌血平板形态产气荚膜梭菌C.perfringens）但生物学性状形态染色：菌体粗大，两端平截的革兰 阳性杆菌。芽胞椭园形，位于次极端。有明显荚膜。5培养I专性厌氧血平板上多数菌株有双层溶血环，内环 是由0毒素引起的较窄的透明溶血 环，外环是由。毒素引起的不完全溶 血环。在牛乳培养基中生长时，发酵乳糖产 酸，使牛奶中酪蛋白凝固，同时产生大 量气体，将凝固的酪蛋白冲碎，并将封 闭的凡士林层顶开，冲至试管口，称 涌发酵”。图6 3产气英膜梭菌荚膜（X2000）图6 4产气荚膜梭菌双层溶血环菌落产气荚膜梭菌（C.perfringei0革兰染色涂片：菌体粗大，两端几乎平切。芽胞呈椭圆形，位于次极端，不大于菌体，体外很少形成芽 胞。汹涌发酵：stormy fermentationClostridium peifringens shows Mstormy fermentation11 of l itmus mil k.Acid turns the pH indicator l itmus from bl ue to pink,acid and enzymes coagul ate the proteins in the mil k,and gas tears the curds apart.Na gl er反应产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶（a毒素），在蛋黄琼脂平板上，卵磷脂酶分解蛋黄中的卵磷脂，生成的甘油二酯在菌落周围 形成乳白色混浊圈。当加入相应抗毒素后，卵磷脂酶活性丧 失，菌落周围不出现混浊圈。破伤风梭菌C.tetani）3是一种创伤感染性细菌，大量存在于土壤、人和 动物的肠道内。破伤风是由破伤风外毒素引起的 一种，肌肉痉挛为特征的神经系统疾病。3生物学性状形态染色：菌体细长的革兰阳性杆菌，无荚膜，有周 身鞭毛。芽胞呈鼓槌状（圆形、大于菌体直径、位于 顶端）。3培养特点：专性厌氧，菌落边缘疏松不整齐，呈羽毛状，易在培 养基表面迁徙生长；在疱肉培养基中混浊变黑。图5-5破伤风梭菌鼓槌状芽胞图5-3破伤风梭菌周鞭毛图5-6破伤风梭菌芽胞超薄切片X 30000图5-2破伤风梭菌晚期纯培养的 镜F形态（48h后，草兰染色）破伤风梭菌鼓槌状芽胞 图工京 普普需右省粤黑手板破伤风梭菌形态学特征艰难梭菌Clostridium difficile o n c yc l o ser in e-c ef o xit in-f r uc t o se a g a r(CCFA);yel l o w g r o un d-g l a ss c o l o n ies肠道正常菌群，与长期 应用抗生素的假膜性肠 炎有关。G+粗大杆菌专性厌氧分离培养困难得名,用特殊培养。须厌氧培养的特点3耗时长需全神贯3克服某些问题：臭味、繁琐3快速操作厌氧培养方法3物理法：厌氧箱或厌氧缸。用物理方法将氧 气吸走，充入氮气、二氧化碳、氢气。3化学法：氢气+氧气钿水3生物法：厌氧菌与需氧菌一起放入密闭空间 培养。分离培养中可能失败的原因3培养前为做标本的直接涂片和染色镜检3标本在空气中放置太久或接种时时间过长3未用新鲜配制的培养基3未用选择性培养基3无合适的厌氧罐或装备出现问题3培养时间*足厌氧菌培养的基本条件及设备3床边采样设备5输送培养基5常规厌氧培养基厌氧血琼脂 BBE琼脂：类杆菌的选择性培养基斯氏琼脂+5%羊血：适用4所有厌氧菌生长斯氏万古霉素+5%羊血：可用于革兰阴性厌氧细菌的分离5厌氧产气袋3厌氧盒或厌氧罐厌氧标本采样方式3采样应规范、正确。3有些实验室用新鲜羊血琼脂代替厌氧培养基；用注射器作为厌氧菌输送厌氧培养标本的工具。这种操作模式，从标本离开人体到厌氧环境可能会使70%-80%的厌氧菌已不能存活。,建议应尽量采纳床边采样方式，或用厌氧 输送培养基，解决标本不能立即送检的问 题。有自动血培养分析仪的实验室，应充 分利用厌氧血培养瓶检测血液、浓液等无 菌体液中的厌氧菌，但应注意勿将注射器 中的气体注入瓶内。3选用厌氧培养基：保存于厌氧环境标本采样及运送3首选：床边采样直接从病变部位取材后接种入相应培养基3肺部标本：不与外界接触、不经过上呼吸道3胸腔：胸腔穿刺3尿道：膀胱穿刺3脓肿：注射器穿刺3女性生殖器：后穹隆穿刺3伤口脓：伤口深部标本或骨坏死处标本注：1、采样后如不能直接接种培养基，必须先种入输送培养基。2、痰、支气管镜采样、咽拭子、排出的尿及阴拭子均不适用厌氧菌3、粪便只能用于难辩梭菌和肉毒杆菌培养厌氧培养装置3厌氧盒+厌氧气袋或厌氧罐+厌氧气袋：方便实用 应用最普遍、简便,厌氧罐抽气换气法：需配置抽气换气装置3厌氧手套箱：较昂贵标本接种原则3 f量在最短的时修内接种完毕,如不能及时接种，请将标本置于输送培养基3先准备好必备的材料，如:厌氧盒厌氧气袋密封装置合适的培养基记号笔，一一Distance Running is about aerobic efficiency and Anaerobic Management所需材料密封装置效果图厌氧菌分离鉴定流程临床标本血平皿 1需氧培养1*24h!需氧菌鉴定报告厌氧血平皿和/或 涂片革兰染色选择性培养基4 记录结果厌氧培养48hI C可疑菌菌落做耐氧试验需,24h 厌氧148h生长 不生长 生长 不生长I t t I*I+兼性厌氧菌或需氧菌 挑取纯分菌产做耐氧试验()需氧菌密涂，为鉴定做准备J-i厌氧生长 需氧不生长涂片并与最初涂片 VITEK API 20A 气相色谱对照有无遗漏 ANI卡 Rapid ID 32APCR 菌种保存 药敏试验Etest或琼脂稀释法耐氧试验需氧培养厌氧培养耐氧试验结果记录而乳土白养厌氧培养12345678第次+第堇 次重要的一点3做耐氧试验时，原始平皿不要丢弃，继续 厌氧培养。主要基于以下考虑：某些厌氧菌生长较缓慢一旦厌氧试验失败（由于操作失误），原始平皿上有备份菌株。耐氧试验平皿厌氧菌的鉴定3 I级实验室应达到的标准：根据耐氧试验结果，革兰染色，菌落特点提供厌氧菌初步 推断报告。3 II级实验室应达到的标准：根据革兰染色反应，镜下形态，菌落形态，耐氧试验，用 自制或国产传统生化反应试剂定种。3 III级实验室应达到的标准：除II级实验室所选择的鉴定方法外，能采用国际公认标准 化鉴定系统。如APL20A、Micro ID Vitek-ANI,气液 相色谱仪。一般操作方法菌液接种9909990909009099培养API 20A(McF)结果阅读API法24-4小时内鉴定庞氧菌API 20 A细菌数:55种-拟杆菌属-普雷沃菌属-口卜啾单胞菌属-韦荣球菌属-葡萄球菌属-消化链球菌属-链球菌属-李生球菌属(4)(2)-梭菌属-丙酸杆菌属-双歧杆菌属-乳杆菌属-真杆菌属-放线菌属-梭杆菌属少所有厌氧菌:杆菌(+),杆菌,球菌(+),球菌(-)6)3)2)2)3)5)3)1/(zl/(/(/1操作步骤3接种物准备打开AP120 A安甑。检查菌株的纯度，用棉签收集在厌氧血琼脂平板上的所有细菌。（如有可 能，最好用分得很开的一个菌落传代所得。）直立握住安甑，以搅动棉签和与安甑壁磨擦，而使菌洗下呈混浊的菌悬 液，棉签可不必取出。最终的混浊度应大于或等于3 McFarland。缓慢生长 的菌应多几个血琼脂平板，以达到接种物的浓度。阿and 33注：要维持厌氧条件，当搅动时防止空气进入培养基。麦氏浊度标准管3不同透光度的系列标准管3(B&SO4浓度增加)标准细菌浓度(CFU/ml)0.51245150X106300 X106600 X106900 X1200X1061500 X106保存:8-30 C试验条准备3准备一个培养盒（盘和盖子），加入约5ml蒸储水或去离子水（或任何无杂 质的水）到盘的蜂窝状凹室内，以创造湿室。3记录菌株资料于盘的沿边（不要记在盖上，以免操作时出错）。3从包装中取出AP120 A试验条，放入培养盘中。3以AP120 A培养基的菌悬液，用无菌吸管接种试验条。接种时，将试 验条稍向前倾斜，避免气泡产生。3对GEL测定，要加满杯和管两部分。3对IND测定，只加管部分，杯内加矿物油，防止口引跺蒸发。3盘子盖上盖子，于35-37厌氧培养24小时。API 20A试条结果阅读3多数厌氧菌所产的反应，在24小时内可明确而容易的读到，但有的菌生 长缓慢，只有在培养48小时后才能鉴定。记录自然产生的反应（不需加试剂）于报告单上。口需加试剂，再看测定结果：1 BCP（澳甲酚紫）：在所有含糖醇类碳水化合物的小管中加1滴BCP试剂。黄或黄绿色表示阳性反应，记录于报告单上。IND测定：力口 1滴XYL（二甲苯）试剂于矿物油覆盖层上，用玻捧充分搅 动，等2一3分钟。力口 1滴EHR试剂。试剂浮在二甲苯/矿物油上（这样不会使 颜色在小管内冲淡）。在5分钟内读结果。红色表示阳性反应，记录于报告单。CAT测定：试验条在空气中暴露30分钟后，检测接触酶的产生。力口2滴30%的H2O2到阳性反应的小管内，有气泡产生表示阳性反应，记录于报告单。结果阅读读测定底物反应/酶结 果阴 性阳 性IND色氨酸呻味形成XYL-mix/2-3min+HER/5 min黄色红色URE限素腑 酶黄-橙色红色GLU葡萄糖产酸BCP 紫红色黄色/黄绿色MAN甘露醇产酸紫红色黄色/黄绿色LAC孚L 糖产酸紫红色黄色/黄绿色SAC蔗糖产酸紫红色黄色/黄绿色MAL麦芽糖产酸紫红色黄色/黄绿色SAL柳醇产酸紫红色黄色/黄绿色XYL木糖产酸紫红色黄色/黄绿色ARA阿拉伯糖产酸紫红色黄色/黄绿色GEL明胶水解(蛋白酶)色素不扩散(1)黑色素扩散(1)表ESC七叶灵水解(B-葡萄糖玳酶)黄 色(2)inUV(365 nm)荧 光棕黑色(2)无荧光GLY甘油产酸BCP 紫红色黄色/黄绿色CEL纤维二糖产酸紫红色黄色/黄绿色MNE甘需热产酹笠幻仇黄邑/黄颂色MLZ松叁糖产酸紫红色黄色/黄绿色RAF棉子糖产酸紫红色黄色/黄绿色SOR山梨醉产酸紫红色黄色/黄绿色RHA鼠李糖产酸紫红色黄色/黄绿色TRE海藻檐产酸紫红色黄色一/黄绿色CAT接岫酶30分钟后在规定管中产生H2O2气体无气体有气体SPOR芽抱无有GRAM革主1氏反应粉红色紫罗亚色COCC形态杆状球 状(1)在园般中培养，色素只在管的底部扩散。(2)褐黑色素，有时试验条只在暴露在空气后才有；读结果时应考虑这一点。黑色素是由于H2s与柠檬酸亚铁反应形成硫化亚铁(FeS)形成所致，这不表示七叶灵水解。这两者区别：FeS形 成管底部的黑色沉淀；而七叶灵水解在管顶部形成褐黑色。如果管全部变黑，则结果还需用紫夕卜灯荧光检查。opA 20 记录反应结果并计算编码8目No0 BREF.:l l l/1 l/1 lOrigine/Source/Herkunf t/Origen/Origem/HpoeAEuaq/Ursprung/Oprindelse/Pochodzenie:,ERX u EccCC日9小:、1：2：4Ident./TauTOTToirjar:03USU.u w l J d-8UUSU.co QealAutres tests/Other tests/Andere Tests/Otras pruebas/Altri test/Outros testes/AAA区 ETdaig/Andra tester/Andre tests/Inne testy:脆弱类杆菌根据编码查找相应的细菌3在API 20 A报告单上有20个测定，加上接触 酶和3个形态特征：POR芽胞：+、-z GRAM革兰氏染色反应：+OCC是否球状：+、-够这些测定每3个一组，每测定标出1、2、4的 数值。将每组的阳性反应的数值相加，得 到一个8位数，它们形成数值谱。磔举例：46546240为脆弱类杆菌R6f.20 390-4 654 623 0faible discriminationLOH DISCRIMINATIONopi 20 ABac.distasonis Por.gingivalis Bac.ovatus/thetaio.%id=5M 1=0.80 Zid=42,9 T=0.65 Nid=5.5 T=0.57(CAT(ARA【ND77Z)885!)(CEL80ZMARAIBac.distasonis 5Z)IPor.gingiualis 99?)IBacteroides o;IBac.thetaiotac4 654 624 0 TRES BONNE IDENTIFICATION.(Bacteroides fragi I is.N0 fiNAG(IGAl|GUU$AC LARa|dARL-iOWGAl,|：Rfc_RHAINO|CEl SOfl-MAL|ApA37培养4 h厌氧环境!4 McF菌液制备培养基32x55 1V 需氧环境!厌氧菌的保存厌氧菌保存关键原则3菌种必须分纯3最短的时间内完成3挑取尽可能多的细菌于保存液中厌氧菌种保存方法3血液保存法血液在低温-40以下，形成低氧化还原电势。材料：新鲜羊血(无菌)无菌小塑料离心管(1-2ml)菌种保存方法：3分装无菌新鲜羊血到无菌小塑料离心管内每管0.8 lmlo3用无菌接种环将待保存菌挑入上述羊血内（超浓菌 悬液）。3同一株厌氧菌最好同时保存2管，备用。3立即置_40以下低温冰箱保存。冷冻真空干燥法3纯厌氧保存菌3将菌苔洗入脱脂牛奶或7%葡萄糖动物血清中（容 量为容器的1/5）3迅速置-40以下冻结3置冷冻真空机柜内，抽真空1624h3升温抽真空，最高温度升至室温侬真空条件下将容器封口谢家Thank you