m-6A去甲基化酶ALKB...编码区双荧光素酶活性的影响_郭励劼.pdf

第 33 卷第 1 期2023 年 2 月生物技术Biotechnology33(1):1Feb.,2023 收稿日期:2022-04-15 基金资助:国家自然科学基金项目(82071527)作者简介:郭励劼(1998-),男,山东省济南人,本科,研究方向:m6A 在抑郁发生中作用及机制,E-mail:guolijie1998 。通讯作者:杨予涛(1972-),男,博士,副教授,研究方向:神经生物学,发表 SCI 论文 30 余篇,获专利授权 1 项,E-mail:yutaoy 。论 著RESEARCH PAPERm6A 去甲基化酶 ALKBH5 对大鼠 S1PR3 基因 3-非编码区双荧光素酶活性的影响郭励劼,王泌林,李琛琛,许婧怡,徐志卿,杨予涛(首都医科大学基础医学院,北京 100069)摘要:目的 明确 m6A 去甲基化酶 ALKBH5 对含 S1PR3 基因 3-非编码区(3-UTR)双荧光素酶报告基因的调控作用。方法 以大鼠前额叶皮层脑区 cDNA 为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增 S1PR3 基因 3-UTR 中含有m6A 修饰位点的目的片段。利用重叠延伸 PCR 方法将三个靶序列 GGACT、GGACT、AGACT 中的第三位 A 突变为 C,并将野生型 S1PR3-3-UTR 片段和突变型 S1PR3-mut-3-UTR 片段分别正向插入到 pmiR-RB-ReportTMvector载体中。将 pcDNA3.1-ALKBH5 或空载体 pcDNA3.1 与野生型和突变型双荧光素酶报告载体分别共转染 PC12 细胞,并检测荧光素酶活性。结果 成功构建了包含 S1PR3 基因3-UTR 野生型双荧光素酶报告载体 pmiR-S1PR3-3-UTR 和突变型双荧光素酶报告载体 pmiR-S1PR3-mut-3-UTR。荧光素酶活性分析表明与空载体 pcDNA3.1组相比,ALKBH5 可显著降低野生型及突变型 C1 和 C2 报告载体荧光素酶的活性(P 0.05)。结论 初步证明 S1PR3 基因 3-UTR 区是去甲基化酶 ALKBH5 的作用靶点,ALKBH5 通过识别S1PR3 基因 3-UTR 区 C3 处的 m6A 修饰位点而降低 pmiR-S1PR3-3-UTR 荧光素酶的活性。关键词:m6A;1-磷酸鞘氨醇受体 3;抑郁症;pmiR-S1PR3-3-UTR;双荧光素酶活性检测中图分类号:R749 文献标识码:A DOI:10.16519/ki.1004-311x.2023.01.0001Effect of m6A demethylase ALKBH5 on the activity of 3-untranslatedregions of rat S1PR3 gene dual-luciferaseGUO Li-jie,WANG Mi-lin,LI Chen-chen,XU Jing-yi,XU Zhi-qing,YANG Yu-tao(School of Basic Medical Sciences,Capital Medical University,Beijing 100069,China)Abstract:ObjectiveTo explore the effect of m6A demethylase ALKBH5 on the activity of 3-UTR of rat S1PR3 reportergene.Method The 3-UTR of rat S1PR3 gene was amplified by polymerase chain reaction(PCR).Three target sequencesGGACT,GGACT,AGACT were mutated into GGCCT,GGCCT,AGCCT by overlap extension PCR.Then,S1PR3-3-UTR andS1PR3 mut-3-UTR were inserted into pmiR-RB-ReportTMvector,respectively.The pcDNA3.1-ALKBH5 or its controlvector pcDNA3.1 was co-transfected with wild type or mutant reporter vectors into PC12 cells and luciferase activities weremeasured.Result The wild type pmiR-S1PR3-3-UTR vector and the mutant pmiR-S1PR3-mut 3-UTR vector weresuccessfully constructed.Luciferase activities demonstrated that pcDNA3.1-ALKBH5 decreased the activity of wild type re-porter vector or mutant C1,C2 reporter vector(P 0.05).Conclusion The rat S1PR3 gene 3-UTR is a potential target of m6A demethylase ALKBH5.ALKBH5 decreases the activityof pmiR-S1PR3-3-UTR by recognizing the m6A site at C3 in the 3-UTR region of the S1PR3 gene.Keywords:m6A;sphingosine 1-phosphate receptor 3;major depressive disorder;pmiR-S1PR3-3-UTR;dual-lucif-erase activity 抑郁症是一种持续出现快感缺失、绝望无助和情绪低落为主要临床症状的精神类疾病1。全球已有超 3.5 亿的抑郁症患者,具有高发病率、高致残率和高自杀风险的特点,给患者、家庭和社会造成沉重的负担2。因此,抑郁症已成为严重影响社会经济发展,迫切需要解决的公共卫生问题,深入探讨抑郁生 物 技 术2023 年症的发病机制具有重要的理论和现实意义。m6A 是真核细胞中 RNA 最丰富的修饰方式,在转录后水平调控基因的表达3。m6A 修饰由三种核心组分甲基转移酶复合物 METTL3(methyltransferase-like 3)、METTL14(methyltransferase-like 14)、WTAP(Wilms tumor 1 associated protein)来催化。RNA 去甲基化则由两种去甲基酶 FTO(fat mass andobesity-associated protein)和 ALKBH5(alkB homo-log 5)来 执 行3。研 究 表 明,m6A 主 要 出 现 在DRACH(即AGUAGACACU)基序上。m6A在脑组织中表达丰度较高,当 m6A 修饰及其调节蛋白的水平发生异常,将导致脑组织发育缓慢和轴突再生能力减弱,进而引起神经系统功能的改变4。RNA 去甲基化酶 ALKBH5 在小鼠大脑中广泛分布,在小鼠的小脑和嗅球等部位表达较高。随着小鼠大脑发育,ALKBH5 的表达明显降低5。对中国汉族 738 个抑郁症患者与1 098个对照受试者中的 23 个单核苷酸多态性进行了分析,发现 ALKBH5的多态性与抑郁症的发生有很强的相关性6。在星形胶质细胞中过表达环状 RNA STAG1 可抑制 ALK-BH5 由胞质向胞核转运,导致 FAAH 基因 mRNA 的m6A 修饰水平的下降,促进了 FAAH 的降解,从而改善星形胶质细胞的功能,最终减轻抑郁样行为发生7。S1PR3 受体是 1-磷酸鞘氨醇的主要受体之一,调节多种生理和病理过程8-9。研究发现大鼠内侧前额叶皮层(mPFC)中的 S1PR3 可以调节慢性社交应激挫败大鼠的抑郁易感性。与应激易感和对照大鼠相比,应激抵抗大鼠 mPFC 中 S1PR3 表达明显升高。通过慢病毒在 mPFC 中敲低 S1PR3 的表达将导致正常大鼠产生抑郁样行为,而过表达 S1PR3可改善大鼠的抑郁样行为10。尽管人们对 S1PR3在抑郁发生中的作用有了一定了解,但 S1PR3 基因是否存在 m6A 修饰的位点,ALKBH5 能否通过影响S1PR3 基因的 m6A 修饰而调节 S1PR3 基因的表达至今仍未见报道。基于上述原因,笔者首先利用 SRAMP m6A 在线预测网站预测大鼠 S1PR3 基因的 3-UTR 区是否存在 m6A 修饰位点。然后,以大鼠 S1PR3 基因 3-UTR 区为研究对象,将 S1PR3 基因 3-UTR 克隆到pmiR-RB-ReportTM载体中。同时,将 S1PR3 基因3-UTR 中 m6A 修饰位点进行突变,构建含有S1PR3 基因 3-UTR 突变型的双荧光素酶报告载体。通过双荧光素酶活性检测系统分析 m6A 去甲基化酶 ALKBH5 对野生型及突变型 S1PR3 基因3-UTR双荧光素酶活性的影响。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验材料双荧光素酶报告载体 pmiR-RB-ReportTMvec-tor,广州锐博生物科技有限公司。大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12)株为笔者实验室保藏株。大肠杆菌(E.coli)DH5 菌株,南京诺唯赞生物科技股份有限公司。1.1.2 试剂双荧光素酶报告基因检测试剂盒、胶回收试剂盒:山东思科捷生物技术有限公司;单链 cDNA 反转录合成试剂盒:上海罗氏制药有限公司;2 TaqPCR Master mix、DNA marker/:北京天根生化科技有限公司;Prime Star DNA 聚合酶、5 PrimeStar Buffer、dNTPs,日 本 Takara;EcoR 内 切 酶、Not内切酶、Xho内切酶、Hind内切酶、T4 DNA连接酶、10 DNA Ligase Reaction Buffer、电泳核酸染料(6 ),美国 NEB;氨苄青霉素,美国 Sigma。胎牛血清、马血清,美国 Gibco。质粒提取试剂盒,美国OMEGA;0.25%胰酶、LipofectamineTM3000 Regent 转染试剂盒,美国 Invitrogen;胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉,美国 USB。1.1.3 仪器Luminoskan 微 孔 板 读 数 仪 H5300332,美 国ThermoFisher;Nano Drop 2000 紫外分光光度计 ND-LITE-PR,美国 Thermo;聚合酶链式反应(polymer-ase chain reaction,PCR)仪 CFX96,美国 BIORAD;Al-pha Image 凝胶成像系统 BJ001285,美国 HP。B6060细菌培养箱,德国 Heraeus;PYY-7C 恒压恒流电泳仪,北京六一仪器厂。1.1.4 培养基Hams F-12K(Kaighns)培养基,减血清培养基 Opti-MEMI,美国 Invitrogen 公司。PC12 细胞在含有 15%马血清、2.5%胎牛血清的 Hams F-12K(Kaighns)培养基中进行培养,当细胞生长到对数期后进行后续实验。1.2 方法1.2.1 大鼠 S1PR3 基因 m6A 作用靶点预测通过 GenBank 查找大鼠 S1PR3 基因的3-UTR2 1 期郭励劼,等:m6A 去甲基化酶 ALKBH5 对大鼠 S1PR3 基因 3-非编码区双荧光素酶活性的影响序列。利用 m6A 预测网站 SRAMP( S1PR3 基因 3-UTR 的 m6A 位点。1.2.2 大鼠 cDNA 的提取以及 PCR 扩增随机挑选一只成年正常 SD 大鼠,用 6%水合氯醛麻醉后,取其新鲜前额叶皮层脑(mPFC)组织,利用 Trizol 试剂盒,按说明书操作提取其总 RNA。利用 Nano Drop2000 紫外分光光度计测定 RNA 的浓度,再利用单链 cDNA 反转录合成试剂盒反转录1 g的总 RNA,从而得到大鼠的 cDNA。通过 Gen-Bank 查找得到大鼠 ALKBH5 基因的序列及 S1PR3基因的 3-UTR 序列,设计上下游引物 F-ALK-BH5,R-ALKBH5;F-S1PR3,R-S1PR3(见表 1),然后以大鼠 cDNA 为模板,利用所设计引物分别进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为:5 Prime Star Buff-er 5 L,2.5 mmol/L dNTPs 2 L,10 mol/L 上下游引物各 0.5 L,cDNA 0.5 L,ddH2O 16.25 L,Prime Star DNA 聚合酶 0.5 L。PCR 条件为:预变性98 2 min,98 10 s,56 5s,72 2 min,扩增 30 个循环,72 延伸 3 min。扩增完成后,取25 L PCR 产物与 5 L 电泳核酸染料混合,进行1%琼脂糖凝胶电泳,电泳完成后切胶通过胶回收试剂盒对目的片段的 PCR 产物进行纯化回收。表 1 引物序列Tab.1 Primer sequence引物名称 序列(5-3)备注(下划线处)F-ALKBH5CCCAAGCTTATGGCGGCCGCCAGCGGCTACACHind酶切位点R-ALKBH5CCGGAATTCTTAAGCCCCATACACAGCCAACCEcoR酶切位点F-S1PR3AAATATGCGGCCGCCAGTGAGAGGAATCCGCCAGGCTNot酶切位点R-S1PR3CCCCCCGCTCGAGCCAGAAATGCCTGGGTTTTTTGTCXho酶切位点Smut1-FGCGGGCAGAGGCCTTGGGGAGGGGATTTCAGAGGTGTCTTSmut1-RTCCCCAAGGCCTCTGCCCGCGGGACACACAGGTGGGTATGT突变位点Smut2-FCGTCAGGCCATGGTTACCTAGGGCCCAGGAAAAGTGTCCCSmut2-RCTAGGTAACCATGGCCTGACTAACGAAAGACTTCCCCTGG突变位点Smut3-FAGGGGAAGGCTTTCGTTAGTCAGTCCATGGTTACCTAGGGSmut3-RACTAACGAAAGCCTTCCCCTGGTGGATATAGGTCACTGCC突变位点1.2.3 野生型 pcDNA3.1-ALKBH5 载体的构建用 EcoR、Hind内切酶对胶回收纯化后的PCR 产物以及 pcDNA3.1 载体进行双酶切,酶切体系为:PCR 产物或 pcDNA3.1 载体 1 g,10 Cut-Smart Buffer 5 L,EcoR内切酶 1 L,Hind内切酶 1 L,ddH2O 补齐至 50 L。37 酶切 30 min。利用胶回收试剂盒纯化回收的酶切产物,T4 DNA 连接酶连接。连接体系为:载体 1 L,目的片段 7 L,T4 DNA 连接酶1 L,10 DNA Ligase Reaction Buff-er 1 L。37 孵育 1 h。取 5 L 连接产物加入50 L感受态细胞中,冰上放置 30 min 后 42 热激90 s,再于冰上放置2 min。转化后加入200 L 无氨苄培养基涂板,于 37 培养箱中恒温培养 14 16 h,次日挑单克隆菌落溶于10 L 无菌 ddH2O 中,2 L 用作菌落 PCR 鉴定的模板,剩余加入含氨苄培养基培养,次日提质粒进行双酶切鉴定,之后将鉴定为阳性的克隆测序,测序无误的克隆命名为 pcD-NA3.1-ALKBH5。1.2.4 野生型 S1PR3 基因 3-UTR 的双荧光素酶报告载体的构建 采取相同的酶切体系,用 Xho、Not内切酶双酶切纯化后的 S1PR3 基因的 PCR 扩增产物以及pmiR-RB-ReportTMvector 载体,37 酶切 30 min。纯化回收酶切产物,用上述同样体系和步骤进行连接、转化、涂板。次日,挑单克隆菌落进行菌落 PCR鉴定,并培养菌液提质粒进行双酶切鉴定,将阳性克隆送测序,测序无误的克隆命名为 pmiR-S1PR3-3-UTR。1.2.5 突变型 S1PR3 基因 3-UTR 的双荧光素酶报告载体的构建 利用 SRAMP 在线 m6A 位点预测网站预测大鼠S1PR3 基因 3-UTR 的 m6A 修饰位点,将大鼠S1PR3 基因 3-UTR 中第一个 m6A 修饰位点,即:第 2670-2674 位碱基 GGACT 突变为 GGCCT(C1),第二个位点,即:第 2909-2913 位碱基 GGACT 突变为 GGCCT(C2),第三个位点,即:第 2924-2928 位3生 物 技 术2023 年碱基 AGACT 突变为 AGCCT(C3)。针对第一个突变位点设计上下游引物 Smut1-F、Smut1-R;针对第二个突变位点设计上下游引物 Smut2-F、Smut2-R;针对第三个突变位点设计上下游引物 Smut3-F、Smut3-R。以构建成功的野生型 pmiR-S1PR3-3-UTR质粒作为模板,通过重叠延伸 PCR 的方法进行突变。对 C1、C2、C3 突变位点分别进行两轮 PCR 扩增,第一轮分别以 F-S1PR3、Smut1-R 和 Smut1-F、R-S1PR3,F-S1PR3、Smut2-R 和 Smut2-F、R-S1PR3;F-S1PR3、Smut3-R 和 Smut3-F、R-S1PR3 为上下游引物进行 PCR 扩增。两组 PCR 产物电泳后纯化回收,将回收产物 11 混合,以混合后的 PCR 产物为模板,以 F-S1PR3 和 R-S1PR3 为上下游引物进行第二轮重叠延伸 PCR 扩增。将此PCR 产物纯化回收后,送测序确认这三个位点是否突变成功。将含有 C1、C2 和 C3 位点单突变的 PCR 产物分别经过酶切、连接和转化后,将其克隆到 pmiR-RB-ReportTMvector 载体中,并将其命名为 pmiR-S1PR3-mut1、pmiR-S1PR3-mut2、pmiR-S1PR3-mut3。1.2.6 细胞转染细胞转染分为 5 组:pcDNA3.1+pmiR-S1PR3-3-UTR;ALKBH5+pmiR-S1PR3-3-UTR;ALKBH5+pmiR-S1PR3-mut1;ALKBH5+pmiR-S1PR3-mut2;ALKBH5+pmiR-S1PR3-mut3。采用 LipofectamineTM3000 Regent 转染试剂盒进行转染实验。转染前 1 h,将 24 孔板中的培养基换成 Opti-MEMI 培养基。同时,用 Opti-MEMI 培养基稀释质粒和脂质体后,静置 5 min,随后将两管液体混合,混匀后静置 15 min。将混合后的液体等体积滴加到 24 孔板中,轻轻晃动混匀。转染 4 6 h 后将24 孔板中的液体换为 F-12K 完全培养基。放入培养箱中培养,48 h 后检测双荧光素酶活性。以上实验重复 3 次,每组设置 3 个平行复孔。1.2.7 双荧光素酶活性测定利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测双荧光素酶活性。提前配制 Firefly luciferase 的底物 LAR及 Renilla luciferase 的底物 Stop&Glo。PBS 洗3 次转染 48 h 后的细胞,每孔加入 100 L 1 Pas-sive Lysis Buffer 室温裂解 30 min,随后用 Luminos-kan 微孔板读数仪进行检测。96 孔板中加入细胞裂解液 10 L,LAR试剂 50 L,吹打混匀后,测定第1 个读数记为 LUC,再加入终止液 Stop&Glo reagent试剂 50 L,测定第 2 个读数记为 R-LUC,相对荧光素酶活性为 R-LUC/LUC。1.3 统计分析采用 Graph Pad Prism 7 统计软件对荧光素酶活性数据进行 One-Way ANOVA 分析。数据以(mean SEM)表示。P 0.6)的 m6A 位点,分别将其命名为C1、C2 和 C3,见图 1。图 1 S1PR3 基因 m6A 位点分布预测分数图Fig.1 Prediction score of S1PR3 genes m6A binding sites2.2 大鼠 ALKBH5 和 S1PR3 基因目的片段的扩增以大鼠前额叶皮层脑区的 cDNA 为模板,以 F-ALKBH5 和 R-ALKBH5;F-S1PR3 和 R-S1PR3为上下游引物,使用 Prime Star DNA 聚合酶进行PCR 扩增,成功扩增出长度约为 1 200 bp 的大鼠ALKBH5 基因目的片段(见图 2)与长度约为 560 bp的大鼠 S1PR3-3-UTR 基因目的片段(见图 3),结果与预期大小一致。2.3 野生型 pcDNA3.1-ALKBH5 质粒的构建用 EcoR内切酶和 Hind内切酶,对胶回收纯化后的 PCR 产物以及 pcDNA3.1 载体进行双酶切,然后纯化回收酶切产物。将酶切后剩余载体片段和PCR 产物片段用 T4 DNA 连接酶 37 连接 1 h,然后把连接产物转化到大肠杆菌 DH5 中。菌落 PCR鉴定发现在 1 200 bp 处出现目的片段,菌液培养4 1 期郭励劼,等:m6A 去甲基化酶 ALKBH5 对大鼠 S1PR3 基因 3-非编码区双荧光素酶活性的影响14 h后提质粒并进行酶切鉴定,经过琼脂糖凝胶电泳分析后,重组质粒切出长度为 5 500 bp 和 1 200bp 的片段(见图 4),初步证明野生型 pcDNA3.1-ALKBH5 质粒构建成功。将此质粒送测序,比对后发现插入片段为大鼠 ALKBH5 基因序列,表明成功构建了 pcDNA3.1-ALKBH5 质粒。图 2 ALKBH5 基因的 PCR 扩增结果注解:M:DNA marker;S1:以大鼠前额叶皮层脑区 cDNA 为模板扩增的 ALKBH5 基因的 PCR 产物。Fig.2 PCR products of ALKBH5 geneNote:M:DNA marker;S1:PCR products of ALKBH5 gene fromthe cDNA of rat prefrontal cortex.图 3 S1PR3 基因 3-UTR 的 PCR 扩增结果注解:M:DNA marker;S1:以大鼠前额叶皮层脑区 cDNA 为模板扩增的 S1PR3 基因 3-UTR 的 PCR 产物。Fig.3 PCR products of S1PR3 gene-3-UTRNote:M:DNA marker;S1:PCR products of S1PR3 gene 3-UTRfrom the cDNA of rat prefrontal cortex.2.4 野生型 S1PR3 基因 3-UTR 的双荧光素酶报告载体的构建 用 Xho、Not内切酶双酶切回收纯化后的PCR 产物以及 pmiR-RB-ReportTMvector 载体,之后纯化回收的酶切产物,经连接、转化、涂板后,菌落PCR 鉴定发现在 560 bp 处出现目的片段,菌液培养14 h 后提质粒并进行酶切鉴定。琼脂糖凝胶电泳发现重组质粒切出长度为 5 500 bp 和560 bp的片段(见图 5),初步证明野生型 S1PR3 基因 3-UTR 的双荧光素酶报告载体的构建成功。将此质粒送测序,比对后发现插入片段确为大鼠 S1PR3 基因 3-UTR 序列,表明成功构建了 pmiR-S1PR3-3-UTR 野生型质粒。图 4 重组质粒 ALKBH5 的酶切鉴定注解:M:DNA marker;S1:阳性重组质粒 pcDNA3.1-ALKBH5的酶切结果。Fig.4 Identification of plasmid ALKBH5 by restrictionenzyme digestionNote:M:DNA marker;S1:Identification of plasmid pcDNA3.1-ALKBH5 by restriction enzyme digestion.图 5 重组质粒 pmiR-S1PR3-3-UTR 的酶切鉴定注解:M:DNA marker;S1:阳性重组质粒 pmiR-S1PR3-3-UTR 的酶切结果。Fig.5 Identification of plasmid pmiR-S1PR3-3-UTRby restriction enzyme digestionNote:M:DNA marker;S1:Enzyme digestion identification of plas-mid pmiR-S1PR3-3-UTR.5生 物 技 术2023 年2.5 突变型 S1PR3 基因 3-UTR 的双荧光素酶报告载体的构建 由于 S1PR3 基因 3-UTR 存在 3 个高可信度m6A 结合位点 C1、C2、C3。针对 C1、C2、C3 突变位点进行两轮 PCR 扩增:以上述构建好的野生型 pmiR-S1PR3-3-UTR 质粒作为模板,第一组分别以 F-S1PR3、Smut1-R;F-S1PR3、Smut2-R;F-S1PR3、Smut3-R 为上下游引物进行扩增,第二组分别以 Smut1-F、R-S1PR3;Smut2-F、R-S1PR3;Smut3-F、R-S1PR3 为上下游引物进行扩增。两组 PCR 产物跑电泳后纯化回收,将回收产物 1 1 混合吹打混匀,以混合后的 PCR 产物为模板,F-S1PR3 和 R-S1PR3 为上下游引物进行重叠延伸PCR 扩增,得到长度为 560 bp 的扩增产物。图 6 重组突变质粒 pmiR-S1PR3-mut-3-UTR 的菌液 PCR 鉴定结果注解:M:DNA marker;S1/S2/S3:重组质粒 pmiR-S1PR3-mut1 3-UTR 的菌液 PCR 鉴定结果;S4/S5/S6:重组质粒 pmiR-S1PR3-mut2 3-UTR 的菌液 PCR 鉴定结果;S7/S8/S9:重组质粒 pmiR-S1PR3-mut3 3-UTR 的菌液 PCR 鉴定结果。Fig.6 PCR identification of bacterial fluid ofpmiR-S1PR3-mut-3-UTRNote:M:DNA marker;S1/S2/S3:PCR identification of bacterialfluid of pmiR-S1PR3-mut1-3-UTR;S4/S5/S6:PCR identifi-cation of bacterial fluid of pmiR-S1PR3-mut2-3-UTR;S7/S8/S9:PCR identification of bacterial fluid of pmiR-S1PR3-mut3-3-UTR.将 C1、C2、C3 位点单突变的 S1PR3 基因 3-UTR 的 PCR 产物与 pmiR-RB-ReportTMvector 载体进行双酶切,经连接、转化、涂板后菌落 PCR 鉴定在长度约为 560 bp 处存在目的片段为阳性克隆(见图 6),之后提取质粒再进行酶切鉴定,琼脂糖凝胶电泳发现重组质粒切出长度大约为 6 200 bp、560 bp的片段(见图 7),结果与预期大小一致,之后将质粒送到北京天一辉远生物科技有限公司测序,发现大鼠 S1PR3 基因3-UTR 的 C1、C2、C3 位点均突变成功(见图 8)。表明成功构建了 pmiR-S1PR3-mut1-3-UTR、pmiR-S1PR3-mut2-3-UTR、pmiR-S1PR3-mut3-3-UTR 等三种突变型质粒。图 7 重组突变质粒 pmiR-S1PR3-mut-3-UTR 的酶切鉴定注解:M:DNA marker;S1:重组质粒 pmiR-S1PR3-mut1-3-UTR 的酶切结果;S2:重组质粒 pmiR-S1PR3-mut2-3-UTR 的酶切结果;S3:重组质粒 pmiR-S1PR3-mut3-3-UTR的酶切结果。Fig.7 Identification of plasmid pmiR-S1PR3-mut-3-UTRby restriction enzyme digestionNote:M:DNA marker;S1:Enzyme digestion identification of plas-mid pmiR-S1PR3-mut1-3-UTR;S2:Enzyme digestion identi-fication of plasmid pmiR-S1PR3-mut2-3-UTR;S3:Enzymedigestion identification of plasmid pmiR-S1PR3-mut3-3-UTR.2.6 野生型和突变型S1PR3基因 3-UTR 双荧光素酶报告载体活性的测定将构建成功的 pmiR-S1PR3-3-UTR 或pmiR-S1PR3-mut1-3-UTR,pmiR-S1PR3-mut2-3-UTR,pmiR-S1PR3-mut3-3-UTR 重组双荧光素酶报告载体与 pcDNA3.1-ALKBH5 或其对照 pcDNA3.1 共转染到 PC12 细胞中,转染 48h后,通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒和 Lumi-noskan 微孔板读数仪检测其荧光素酶活性,发现pcDNA3.1-ALKBH5 组与野生型 pmiR-S1PR3-3-UTR,pcDNA3.1-ALKBH5 组与突变型 pmiR-S1PR3-mut1-3-UTR,pcDNA3.1-ALKBH5 组与突变型 pmiR-S1PR3-mut2-3-UTR 报告载体活性下降,而 pcDNA3.1-ALKBH5 组与突变型 pmiR-S1PR3-mut3-3-UTR 报告载体活性与对照组无明显差异(见图 9)。说明 ALKBH5 主要通过识别S1PR3 3-UTR 的 C3 处 m6A 位点,而下调荧光素酶报告载体的活性。6 1 期郭励劼,等:m6A 去甲基化酶 ALKBH5 对大鼠 S1PR3 基因 3-非编码区双荧光素酶活性的影响图 8 重组质粒 pmiR-S1PR3-3-UTR 和 pmiR-S1PR3-mut 3-UTR 的部分测序Fig.8 Partial sequencing results of plasmid pmiR-S1PR3-3-UTR and pmiR-S1PR3-mut 3-UTR图 9 pcDNA3.1-ALKBH5 对野生型和突变型双荧光素酶报告载体活性的影响注解:n=3。数据有统计学差异。(P 0.05,P 0.01,P 0.001,NS 表示没有统计学差异)。所有数据以平均数 标准差(mean SEM)表示。Ctrl+S1PR3:转染空载体 pcD-NA3.1 与 野生型 pmiR-S1PR3-3-UTR 组;ALKBH5+S1PR3:转染 ALKBH5 质粒与野生型 pmiR-S1PR3-3-UTR组;ALKBH5+mut1:转染 ALKBH5 质粒与突变型 pmiR-S1PR3-mut1-3-UTR 组;ALKBH5+mut2:转染 ALKBH5 质粒与突变型 pmiR-S1PR3-mut2-3-UTR 组;ALKBH5+mut3:转染ALKBH5 质粒与突变型 pmiR-S1PR3-mut3-3-UTR 组。Fig.9 Influence of pcDNA3.1-ALKBH5 on the wild typeor mutant reporter vector dual luciferase activitiesNote:n=3.The data were statistically different.(P 0.05,P 0.01,P 0.05),但 pcDNA3.1-ALKBH5 与pmiR-S1PR3-mut1-3-UTR 或 pmiR-S1PR2-mut2-3-UTR 共转染后 PC12 细胞后,其活性与对照组相比则明显下降(P 0.05),说明 ALKBH5 主要作用于 S1PR3 基因 3-UTR 的 C3 位点而调节报告基因的活性。2019 年,Zhuang M 等利用 SRAMP预测网站发现 Robo 家族 Robo3.1 基因存在 m6A 修饰位点,并通过体内外实验证明 m6A 识别蛋白YTHDF1 识别其 m6A 位点而促进 Robo3.1 翻译进而调控轴突的导向19。2020 年,Guo X 等利用野生型PER-1 和突变型 Mut-PER1 报告质粒进行双荧光素酶活性分析,发现在胰腺癌 BxPC-3 和 SW1990细胞中,ALKBH5 可调节上述报告基因的活性20,这与本文结果类似,进一步证明了 ALKBH5 可识别靶基因 3-UTR 的 m6A 位点。综上所述,S1PR3 基因 3-UTR 区是去甲基化酶 ALKBH5 的作用靶点,ALKBH5 通过识别 S1PR3基因 3-UTR 区 C3 处的 m6A 修饰位点而降低pmiR-S1PR3-3-UTR 荧光素酶的活性。本研究为后续阐明 m6A 修饰调控 S1PR3 基因表达的分子机制及其在抑郁发生中作用奠定了基础。参考文献1Uher R,Payne JL,Pavlova B,et al.Major depressive disorder inDSM-5:implications for clinical practice and research of changesfrom DSM-IVJ.Depress Anxiety,2014,31(6):459-471.2Smith K.Mental health:a world of depressionJ.Nature,2014,515(7526):181-181.3 Livneh I,Moshitch-Moshkovitz S,Amariglio N,et al.The m6A ep-itranscriptome:transcriptome plasticity in brain development andfunctionJ.Nature Reviews Neuroscience,2020,21(1):36-51.4 Zaccara S,Ries R J,Jaffrey S R.Reading,writing and erasing mR-NA methylationJ.Nature Reviews 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