SC∕T 3053-2019 水产品及其制品中虾青素含量的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 67.120.30 x 20:才叶|中华人民共和国水产行业标准SC/T 3053一2019水产品及其制品中虾青素含量的测定高效液相色谱法Determination of astaxanthin in fish and fishery products by high performance Iiquid chromatography method 2019-08-01发布2019-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布SC/T 3053-2019 目。昌本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由农业农村部渔业渔政管理局提出。本标准由全国水产标准化技术委员会加工分技术委员会CSAC/TC156/SC 3)归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所、辽渔南极磷虾科技发展有限公司、山东鲁华海洋生物科技有限公司。本标准主要起草人:孙伟红、邢丽红、王联珠、冷凯良、丛心缘、刘冬梅、范宁宁、付树林、李兆新、李风玲、郭莹莹、朱文嘉、彭吉星。I SC/T 3053-2019 水产品及其制品中虾青素含量的测定高效液相色谱法1 范围本标准规定了水产品及其制品中虾青素含量的高效液相色谱测定方法的原理、使用的试剂及仪器、测定步骤、结果计算方法、方法灵敏度、准确度和精密度。本标准适用于鱼类、甲壳类及虾粉、磷虾油等制品中虾青素含量的测定。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注目期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 30891 水产品抽样规范3 原理样品中待测物采用丙酣或二氯甲皖-甲醇混合溶液提取，经碱皂化，使其中的虾青素酣转化成游离态的虾青素，液相色谱分离，紫外检测器测定，外标法定量。4 试剂4.1 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。4.2 丙酣(CH3COCH3)色谱纯。4.3 二氯甲烧(CHzCb):色谱纯。4.4 甲醇(CH30H):色谱纯。4.5 叔丁基甲酷CH3OC(CH3)3J:色谱纯。4.6 磷酸(H3Pl):优级纯。4.7 氢氧化铀CNaOH):优级纯。4.8 2，6-二叔丁基对甲酣(C15H2.1 0):化学纯。4.9腆(lz)。4.10 硫代硫酸铀(NaZSZ03.5H2Q)。4.11 元水碳酸铀(NaZC03)。4.12 元水硫酸筷(MgS04):650DC灼烧4h，在干燥器内冷却至室温，储于密封瓶中备用。4.13 1%磷酸溶液(V/V):量取10mL磷酸和990mL 水，混匀后备用。4.14 二氯甲皖，甲醇溶液:量取250mL二氯甲:院和750mL甲醇，加入0.5g2，6-二叔丁基对甲酷，氓匀后备用。4.15 0.02 moi/L氢氧化饷甲醇榕液:称取0.4g氢氧化$内，用甲醇榕解并稀释至500mL，棍匀后备用o4.16 0.6 moi/L磷酸甲醇溶被(V/V):量取磷酸600L，用甲醇稀释至10mL 4.17 0.01 g/mL 典-二氯甲:院溶液:称取0.1g 砚，用二氯甲烧溶解并稀释至10mL.t昆匀后备用。4.18 0.1 moi/L硫代硫酸铀溶液:称取1.3g硫代硫酸呐，加入O.01 g无水碳酸锅，溶于50mL水中，缓缓煮沸10mio，冷却后备用。4.19 全反式虾青素标准品:纯度二三95%。4.20 全反式虾青素标准储备珞液:准确称取全反式虾青素标准品约10mg，用丙嗣溶解并定容于500SC/T 3053-2019 mL容量瓶中，此榕液浓度为20g/mL.充氮密封.置于一180C冰箱中避光保存，有效期1个月。4.21 虾青素几何异构体的制备:准确吸取全反式虾青素标准储备液(4.20)适量，用丙酣稀释配成10g/mL的标准溶液，移取2mL标准恪液于10mL具塞试管中，加入3mL二氯甲烧，混匀，加入50L0.01 g/mL腆-二氯甲烧溶液(4.17)，充分涡旋，密封置于自然光下反应15min，然后加入1mL 0.1 mol/L硫代硫酸饷溶液(1.18)充分振荡以脱除多余的腆后，静置分层取下相，氮气吹干后加人1mL丙E同情解，现用现配。4.22 N-丙基乙二胶(PSA)填料:粒径40m60mo5 仪器5.1 高效液相色谱仪:配紫外检测器。5.2 分析天平:感量0.01gc 5.3 分析天平:感量0.0001 5.4 分析天平:感量O.00 5.5 超声波清洗仪。5.6 离心机:转速85.7 涡旋混合器。5.8 氮吹仪。6 测定步骤6.1 试样制取代6.2 提取6.2.1 鱼类、称取试样旋，150C以下10 mL丙回重6.2.2 虾粉称取试样115 min,8 000 r/m 合并提取液，混匀。6.2.3 磷虾油称取磷虾油O.2 g(4.14)，涡旋混匀，150C以注:虾青素含量高于100mg/峙的6.3 皂化和净化丙酣，充分涡，残渣中加入下超声波提取复以上过程，mL二氯甲:皖-甲醇海被准确移取2mL样品提取液于10mL具塞试管中，加人2.9 mL O.02 mol/L NaOH甲醇溶液(4.1日，涡旋混合，充氮密封，在4cC5cC冰箱中反应过夜12h16 h。然后在试样溶液中加入0.1mL 0.6 mol/L磷酸甲醇溶液(4.16)中和剩余的碱，再加入100mg PSA填料，涡旋混合，静置5min，过O.2m微孔滤膜后，待测。6.4 测定6.4.1 色谱条件a)色谱柱:C30色谱柱，250mmX4.6 mm，5m，或相当者;b)柱温:250C;2 SC/T 3053一2019c)流速:1.0 mL/mino d)检测波长:474nmo e)流动相:A为甲醇，B为叔丁基甲基酶，C为1%磷酸珞液s梯度洗脱程序见表1。表1流动相梯度洗脱程序时间，min八，%.%C.%O 81 15 4 15 66 30 4 23 16 80 4 27 16 80 4 30 81 15 35 81 15 6.4.2 标准曲线绘制准确移取适量全反式虾青素标准储备陪液(4.20)用试样定容溶剂稀程成浓度分别为0.1g/mL、O.5g/mL、1.0g/mL、2.0 g/mL、5.0g/mL、10.0g/mL的标准工作液，现用现配。6.4.3 液相色谱测定6.4.3.1 定性方法分别注人20L全反式虾青素标准工作液(6.4.2)、虾青素几何异构体(4.21)和试样溶液(6.3)，按6.4.1列出的色谱条件进行液相色谱分析测定，根据虾青素几何异构体色谱图中13-顺式虾青素、全反式虾青素和9-顺式虾青素3种虾青素同分异构体组分的保留时间定性。色谱图参见附录A。6.4.3.2 定量方法根据试样榕液中虾青素的含量情况，选定峰面积相近的全反式虾青素的标准工作液单点定量或多点校准定量，试样测定结果以3种虾青素同分异构体的总和计，外标法定量，同时标准工作液和样液的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。7 结果计算试样中虾青素的含量CX)按式(1)计算，保留3位有效数字。(1.3 X A13ris+Aalls+1.1 X A9.cis)X C,XV,/I f.C 1)A,X 171 J 式中:X 一-样品中虾青素的含量，单位为毫克每千克Cmg/kg);1.3 一-13-顺式虾青素对全反式虾青素的校正因子;A13-cis一-试样溶液中13-)1回式虾青素的峰面积;A trans 一一试样府液中全反式虾青素的峰面积;1.1 一一+顺式虾青素对全反式虾青素的校正因子;A9-cis 试样溶液中9-)1质式虾青素的峰面积;c,一一标准工作液中全反式虾青素的含量，单位为微克每毫升(g/mU;V 一一战样榕液体积，单位为毫升(mU;人一一全反式虾青素标准工作掖的峰面积;m 一一样品质量，单位为克(g);f 一一稀释倍数。8 方法定量限、回收率和精密度8.1 定量限鱼类、甲壳类中虾青素的定量限为2.5mg/kg，虾粉中虾青素的定量限为5mg/kg，磷虾油中虾青素SC/T 3053-2019 的定量限为10mg/kgo 8.2 回收率本方法原加榷度为2.5 mg/kg 100 mg/kg时，回收率为90%1l0%。8.3 精密度本方法的批内变异系数10%，批间变异系数10%。4 A.1 异拘化的标准溶渣色i昔图见图A.LA.2 全反式见图A.20 mAU 70 60 30 20 10。-10。10 附录A(资料性附录)色i普图20 图A.2全反式虾青素标准溶班色i曹图(1g/mL)SC/T 3053-2019 mm b SC/T 3053-2019 A.3 南极磷虾样品色i普图见图A.30 mAU 25 20 15 10 E8 n a HU Eh.c-5。-5-10-15 0 nu l 20 图A.3南极磷虾样品色谱图A.4 南极磷虾加标样晶色i普图(添加水平2.5mg/kg)见图A.40 mAU 25 20 15 10 Ru n a k h唱机.。5。-5-10-15 0 10 20 图A.4南极磷虾加标样晶色谱图(添加水平2.5mg/kg)6 mln mln SC/T 3053-2019 A.5 南极磷虾粉样晶色i昔图见图A.50 mAU 25 20 15 见图A.A.6-15 0 I E Et l n 10 20 图A.6南极磷虾粉加标样品色i昔图(添加水平5mg/kg)7 SC/T 3053-2019 A.7 南极磷虾油样品色谱图见图A.7。mAU 25 20 15 10 5。-5-10-15 0 10 EE Elmns 20 图A.7南极磷虾油样晶色谱图A.8 南极磷虾油加标样品色i昔图(添加水平10mg/kg)见图A.80 mAU 25 20 15 10 lrans 5。-5-10-15 0 10 20 图A.8南极磷虾油加标样品色谱图(添加水平10mg/kg)8 rln 111m