DB63∕T 778-2009 羊梭菌性疾病诊断技术规范(青海省).pdf

TCS 备案号25054-2009DB63 主同海省而blTJ 方标准DB63/T 778-2009 羊梭菌性疾病诊断技术规范2009-03-30发布2009-04-30实施青海省质量技术监督局发布DB63/T 778-2009 目;欠前言.IIl范围.12规范性寻|用文件.13术语.14临床诊断.15病国剖检.26病原分离和鉴定.2附录A(规范性附录)培养基制备.5A.l 血液琼脂.5A.2厌氧肉肝汤配制.5A.3牛乳培养基.5A.4肉肝胃酌消化液培养基.5DB63/T 778-2009 目IJ1=1 羊梭菌性疾病是由梭状芽胞杆菌届中的病原微生物所引起的一类急性传染病。包括羊快皮、羊肠奇血症、羊猝瘟、羊黑疫和羔羊病疾，是羊的一种重要传染病，其发病率和死亡率较高，严重影响着养羊业发展。为规范芋梭菌性疾病诊断技术，有效控制芋梭菌性疾病的发生和流行，依据中华人民共和国动物防疫法、青海省实施中华人民共和国动物防疫法的有关规定，结合青海省实际恬况，特制定本规范。本规范按GB!T1. 1-2000 (标准的结构和编写规则进行编制。本规范的附录A为规范性附录。本规范由青海省农牧厅提山并归口。;本规范由青海省质量技术监督局批准。木规范由青海省动物疫耐预防控制巾心负责起草。木规范主要起草人:沈艳丽、马睿麟、蔡金山、王晓润、邢建民、张茂中、都占林。TT 羊梭菌性疾病诊断技术规范1 范围本规范规定了羊梭菌性抗病的诊断技术要求本规范适用于羊梭菌性疚病的诊断2 规范性引用文件DB63/T 778-2009 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改甲(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是台可使用这些文件的最新版本。)也是不注且期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB 4789. 13 食品卫生微生物学检验产气英膜梭菌检验GB 4789.28 食品卫平k微牛物学检验染色法、培养基和试剂GB!T 18635动物防疫基本术语3 术语3. 1 临床诊断通过|临床观察和检查对病例的病性和病情做出判断。3. 2 病理检查对动物(尸)体进行解剖检奇和生日织学检杏，以发现其病理学变化，作为疾病诊断的依据之一。3. 3 实验室诊断采取病料，进行病原培养、动物试验，做出诊断结果。3.4 病原分离通过相院试验操作程序，从样品中取得致病性生物的纯培养物。3. 5 病原鉴定通过试验对病原分离物定忡。3. 6 中和试验抗体与抗j泉结合后可使病原体失去感染性或使外毒素失去毒性，并表现为对细胞或动物的免疫保护作用。4 11面床诊断4. 1 羊快疫:患羊常无|陆诊症状IJ突然死亡。病程稍缓者，表现为不!S1i走，运动失调，腹痛、腹泻，磨牙抽擂，最后衰弱昏迷，口流带血j包沫，多于数分钟或几小时内死亡，病程极为短促。4. 2 羊肠毒白症:发病突然恼羊呈腹痛、ijl胀症状。患病羊常离群呆立、卧地不起或独自奔跑。濒死期发生肠呜或腹泻，排出黄褐色水样稀粪，病羊全身颤抖，磨牙后仰，口鼻流沫，于昏迷巾死去。DB63/T 778-2009 4. 3 羊狞祖Lj羊快疫、羊肠毒血症极为相似，M呈短促，常未见出现临床症状，突然死I二。病羊表现押群，卧地，烦X不安，机体衰弱，全身在辈，在数小时内死亡。4. 4 羔羊州快:多发生于210r:i龄羔羊，以拉稀为主要特征。病初精神萎顿，低头拱背，小愿吃奶?不久就发生腹泻，粪便恶臭，在重成为血便，常在1d2d内死亡。4. 5 羊黑疫:病程短足，大多数发病羊只表现为突然死亡。部分病例可拖延1d2d。常表现食欲废绝，反生停止，精神不振，放牧J卓群，呼吸急促，体温41.50C左右，昏睡俯卧而死。于要发牛伞于春夏季节、肘片吸虫感染的低;土地，发病羊多为l岁以上肥胖羊。5 病理剖检5. 1 平快疫:剖检多见死了伞尸体迅速腐败膨胀。可视粘膜充血早暗紫色。体腔多有积液。特征性表现为真冒出血性炎症，胃底部及幽门部粘膜可见大小不等的出血斑点及坏死区，粘膜F发牛水肿。肠道|与充满气休，常有充血、出血、坏死和损荡。心内、外膜可见点状出血。胆囊多肿胀。5. 2 羊肠毒血症:胃肠变化Il1j羊快疫，其主要特征为忏月1、实质变软，严重时肾脏软化如泥样，又称软肾病。5. 3 羊猝祖:与羊快疫、羊肠毒自症极为相似，剖检可见小肠严重出血蝶烂体腔内多有积液，浆膜上小点出血，肌肉出血有气性裂孔。5. 4 羔羊俐疾:真胃内有未消化的是乳块，小肠粘膜充血出血，病程长者叫见直径1mm2mm的溃肮肠系膜淋巴结肿胀充血。5. 5 羊黑疫:剖检可见尸体皮下静脉思著淤血，皮肤呈暗黑色外观。直目幽门部、小肠粘膜充血、什lI血俨肝脏充血、肿胀，表面和深层有数目不等的灰黑色凝固性坏死灶，界限清晰，闻网有一鲜红色充血千if问绕，坏死灶切面呈半圆形。6 病原分离和鉴定6. 1 羊快疫6. 1. 1 形态与染色病国为腐败梭菌，革兰氏染色阳性的厌氧大丰|菌，能产生芽胞，不形成英膜，用肝脏被膜故制(片1呈无关节长丝状。6. 1.2 分离培养将样品划线接种J血液琼脂平皿，胃:厌氧环境中培养长成薄纱状，菌落直径2mm4mm，稍隆起，灰色，边缘不整齐，菌落外有狭窄的浴血区，在深层马I琼脂平板内形成致帘的小绒球状菌落。血液琼脂培养基配制方法见附录A.1，马丁琼脂按GB4789.28第4.7.5条规定配制。6. 1.3 生化试验6. 1.3. 1 对葡萄糖、麦芽糖、乳糖、果糖及水杨昔产酸产气，对庶楠、木糖、甘豆豆醇均不产酸。精发酵管按GB4789.28第3.2条规定配制。6.1.3.2 能产生硫化氢，还原硝酸盐和液化明胶。培养基分别技GB4789. 28第3.14条、第3.17条、第3.10条规定自己制。6. 1.4 动物接种试验用24小时培养的厌氧肉肝汤南液O.5mL肌肉注射豚鼠，12h36h死|气。死亡动物有南血症，可从心血分离出细肉。以氧肉HT汤配制见A.2。对小鼠的最小致死量般为O.1-0. 0025mL ，对豚鼠为O. 02-0. 0025mL。6. 2 羊猝姐、肠毒血症、羔羊前疾病国体分别为C刑、D刑和B刑产气芙膜梭菌。6.2.1 形态与染色革戈氏染色阳性粗大叫端钝圆的杆雨，j己鞭毛、不运动，在动物体内能形成英膜，芽胞位于肉体中2 DB63/T 778-2009 央。6. 2. 2 分离培养病料(检测到肠毒素的肠段)接种于绵羊血琼脂平板上，置厌氧7个境中培养24h48h可形成直径1mm3mm、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄包、表由光滑半透明的菌落，大多数菌株可产生双环溶血，外围是由毒素产生的不完全溶血环。6. 2. 3 生化鉴定6.2.3.1 接种于牛乳培养幕8h10h后，分解牛乳中的手L糖，使1二乳酸凝固，同时产生大量气体便凝块破裂成多孔海绵状，严重时被j中成数段，甚至喷山管外，即爆性发酵。牛乳培养基配制右法见附录A.3 6. 2. 3. 2 木菌能分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖及果糖，产酸产气，不分解甘露醇及水杨昔。精发酵管按GB4789.28第3.2条规定自己制。6. 2. 3. 3 能产生硫化氢，还原础酸盐。培养基分别按GB4789.28第3.14条、第3.17条规定配制。6. 2. 4 动物接种试验6.2.4.1 毒素测定:取Iwl肠内容物1份，加生理盐水1倍4倍，充分混合后，以每分钟3000转速度尚心30分钟，然后静脉注射家兔(2mL4mU小白鼠静脉注射(0.2mL0. 4mU ，如引起急性死亡，证明肠内容物含有毒素。把分离纯净的细菌接种于厌气肉肝汤中，370C培养3天后，离心取上洁液O.2mL给小白鼠静脉注射测定最小致死量后，作中和试验:另外取上清液1mL，加含有0.25%膜酶的1%碳酸铀溶液1mL, 370C活化40分钟后，再进行测毒，如有死亡，说明有毒素存在，可用D型及C型血清作中和试验，以判型别。6. 2. 4. 2 毒素定型:将肠内容物作倍比稀释后，把各科秤度Hm内容物分别静脉注射小内鼠，根据小白鼠死亡情况，测定其最小致死量。然后取定型血清O.05mL0. 1mL，加入25个最小致死量的毒素液，加牛2甲盐水使其总量达O.2mL0. 3mL, 370C温箱放置40min，使抗存素与毒素充分作用，全量注射小白鼠，观察24h，记录生存和死亡，按下表判定结果。表l魏氏梭菌中和试验各种反应结果混介飞第一种结果第种结果第一斗中结果第四种结果B型血清十肠内容物或培养物七清;吕ir& i吕i& 肠毒主肠毒草是E肠毒主是B型肠毒亲是月C型血清+肠内容物或培养物上清活死死活是C型型或E型型D型1(11洁+肠内容物或珩养物上洁死活死活6. 3 羊黑疫:6.3.1 形态与染色:病因为B塑诺维民梭菌，是革兰民阳性大杆菌，形成芽炮，不产生芙膜，有鞭毛?能运动，用肝脏坏死病灶边缘的组织抹片镜检，可看到来)、杆菌。6.3.2 分离培养:取死羊实质器官，尤其是肝脏上的坏死灶接种于加有新鲜生肝块的厌气肉肝汤中，3TC培养72小时，将产生气体该菌在厌气肉肝汤巾不生长或生长极微弱，在加有生肝的厌氧肉肝汤巾生长良好井产气)抹片、染包t克检，观察形态。如有杂商，可加热800C10min纯化。纯净的培养物叫接种于不加生肝块的肉盯胃酶消化液培养基中，3TC培养72小时，离心取上沽液注射小白鼠，并测定其致死量，一般为200010000MLD/mL。然后，取其七洁液与寺量的B型诺维氏梭曲血沽作中和试验，做出最后诊断。肉月干胃酶消化液培养基配制方法见附录A.4。6.3.3 动物接种试验:将病理材料泪悬液肌肉注射豚鼠，每片豚鼠皮下注射2mL，于1d3d内死亡，死后剖粉可见注射部位有出血性水肿，腹部皮h组织呈胶样水肿，透明无色或玫瑰色，厚度有时可达1cm，且可向前延伸至颈部。该毒素在碱性(PH8.0)环境中可卡皮肤酶破坏。3 DB63/T 778-2009 6. 3. 4 毒素检查:中和试验取培养物r.百液1m1与1m1B型诺维氏峻菌诊断血泊混合，3TC作用45min，静脉注射小臼鼠，同时设对照、组。如果对照组小白鼠死亡(表示被检材料含有毒素)，试验组小白鼠存活(说明毒素可被B刑诺维氏梭菌定刑血清中和)，即产毒案菌为B7诺维氏梭菌4 DB63/T 778-2009 附录A(规范性附录)培养基制备A. 1血液琼脂A. 1. 1 成分牛肉膏.5g 蛋门陈10g 氯化铀5g 磷酸氢二锦19 葡萄糖5g 琼脂20g 茶馆水1000mL A. 1.2 制法将PH值调为7.47. 6后，1210C高压灭菌20min，将普通琼脂凉至500C左右，按55%10%量加入无菌抗凝或脱纤血液，泪匀后倾注1平JTLA. 2 厌氢肉肝汤配制A. 2.1 成分牛肉汤C1:2) 500mL 肝汤C1:2) 蛋白陈氧化铀葡萄糖500mL 10g :Jg :Jg A.2.2 制法加热溶解，将PH值调为7.88. 0，分装于中试管中，上加石蜡泊，下加肝块(取动物新鲜肝脏，经1000C加热20min30min使蛋白凝固，取出用刀切成O.3cm左右的小块，放于试管底，加入七述培养其6mL-8mL，液面盖以石蜡;由), 15眩高压蒸气灭菌20min30minoA. 3 牛乳培养基A. 3.1 成分脱脂I1号L100mL 1. 6%澳甲酣酒精溶液O.1mL或8%石在的40%乙醇溶液适量A.3.2 制法取新鲜牛手L(也可用奶粉配制成10%水溶液代替)，加热或高，已、去掉脂肪。将指示剂加入脱脂牛乳内，分装于小试管中，以1150C高压蒸汽灭菌20minoA.4 肉肝胃酶消化液培养基A. 4.1 成分消化液蛋们脏葡萄糖IL m n 口gnnu ttitti 5g 5 酵母膏A. 4. 2 制法5g DB63/T 778-2009 取新鲜去筋脏、去脂肪牛肉200g，新鲜肝脏5g，水1000mL ，盐酸12.5 mL，目蛋白酶(1: 10000) 1. 25 g, 520C-540C消化20h，滤洁。加入上:&:成分济解后，用1NNaOH将PH值调为7.88. 0，分装于小试管中，上加石蜡油，门口肝块，15磅高压蒸气灭菌20min30min。6