DB63∕T 863-2009 实验室冬虫夏草真菌 中国被毛孢真菌保存技术规程(青海省).pdf

TCS 备案号26842-2010DB63 主同海省而btTJ 方标准DB63/T 863一-2009实验室冬虫夏草真菌一中国被毛抱真菌保存技术规程2009-12-07发布2010-01-10实施青海省质量技术监督局发布DB63/T 863-2009 目次1也围. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2术语. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3菌种制备. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3. 2菌种纯化方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 4菌种保存方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 4. 5冬虫夏草真菌的保存步骤. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 6保存菌种的复壮. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 -目IJE司本规程由青海省畜牧兽医科学院提出并归口。本规程由青海省畜牧兽医科学院草原所负责起平。本规程起草人:李王玲、马少丽、刘欣、徐海峰、张宗豪。本规程由青海省质量技术监督局批准发布。DB63/T 863-2009 II 实验室冬虫夏草真菌一中国被毛子包1 范围本规和规定了冬虫夏草真菌分高培养后的保存技术措施。本规和适用于冬虫夏草真菌中国被毛胞分离培养后的保存。2 术语2. 1 2. 2 2. 3 2. 4 中国被毛于包(Hirsutellasinnsis Liu,Guo, Yu & Zeng) 指冬虫夏草的无性型。菌种冬虫夏草体内分离时巾国被毛抱。无菌操作指采用经过一定消毒措施处理之后的环境、器具及人为操作的工作方式。培养基DB63/T 863-2009 是供做生物、植物和动物组织牛长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氧物质、兀机盐(包括微量元素)以及维牛东和水等。有的培养基还含有fJL菌素和色素。2. 5 菌种纯化有一种以上的内做敖牛刀那IS么这个曲落称为纯培养，这个过程就是菌种纯化。2. 6 菌种衰退菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标i己的丢失等现象。2. 7 菌种保藏就是对活体微生物群体进行有效的保藏的生物学方法。2. 8 水活度(Aw)是影响丁燥菌种保藏稳定性的重要因素。3 菌种制备3. 1 菌种纯化3. 1. 1 纯化菌种用培养基配方3. 1. 1. 1 牛肉汤的制备DB63/T 863-2009 3. 1. 1. 1. 1 先将新鲜牛肉去除筋和脂肪，然后取1kg牛肉加茶馆水2kg放入容器内煮沸，煮沸约40分钟后将肉渣滤去，肉水经121C、O.1MPa高原灭由30min后备用。3. 1. 1. 1. 2 注意:煮沸时应边煮边搅动:煮沸前应在容器壁上划一刻度，煮沸时随时添补蒸馆水。3. 1. 1. 1. 3 固体培养基C1000ml)牛肉汤500ml、牛奶200ml、葡萄糖30g、琼脂18g、水解乳蛋白5g、酵母浸音19、磷酸氢二佣19、核糖核酸O.挝、硫酸馍O.址，力口水定容至1000mL3. 1. 1. 2 液体培养基:液体培养基自己方不加琼脂外，按照本标准3.1. 1. 1. 3固体培养基制备方法进行制备。3. 1.2 培养基的制备3. 1. 2. 1 固体培养基:按照本标准3.1. 1. 1. 3中的配方，依次加入水解乳蛋、酵母、葡萄糖、磷酸氢二号甲、硫酸镜、核糖核酸和琼脂放入容器内加热煮沸溶化后备用:量取牛奶200ml加热煮沸后取F备用:将上述溶液和牛肉汤共同放入容器中加水定容主1000ml，煮沸后，用1N的盐酸或1N氢氧化铀调训PH6.7，分装于试管内(中试管每支6ml7ml) , 115C、O.075MPa灭菌30min后取出摆成斜而备用C3.1.2.2 液体培养基:将上述溶液除去琼脂不加，和牛肉汤共同放入容器中煮沸后，用1N的盐酸或1N氢氧化铀调制PH6.7，分装于250ml三角瓶内(每瓶装150ml) , 115C、O.075MPa灭菌30mi口后备用。3. 1.3 菌种纯化方法将实验室分离培养得到的冬虫夏草真菌，纤显微镜检查确认为中同被毛也后，将该菌落边缘挑取少量菌丝体，接种在纯化用固体培养基上，10C 15C条件下培养。待菌丝长满斜面后，再接种到纯化用液体培养基中，在10C15C、120r/min条件下，每天10小时连续进行震荡培养，待震荡培养至液体中长出雨丝球后再次转接到固体培养基巾。反复移植2次3次，即达到南丰111纯化。4 菌种保存方法4. 1 试管继代保存法(斜面低温保藏法)4. 1. 1 将长满雨丝的斜面培养基，置4C6C下保存，保持温度稳定，每5个月6个月传代二次。此应法最多只能传代3次4次，4代后就失去了活力。4.1.2 随时观察保藏南株的活力和纯度，一旦染杂，进行剔除。4. 2 试管石蜡液体保存4.2.1 液体有蜡保藏法:将化学纯液体石蜡经121C、O.1MPa灭菌30min后，兀菌注入试管斜面培养物上，使液面高山试管斜面1cm，试管口塞上胶塞成棉塞，4C冰箱保藏。使用时，倒去液体有醋，用无菌水洗涤斜面菌种1次2次，进行接种。4. 2. 2 将菌种移殖到液体培养基，置5C8C条件h保存，保持温度稳定。此方法可保存1.5年2年。4. 3 冷冻真空干燥保存冷冻真空干燥法的主要步骤JJ:准备安Zfl.管制备脱脂牛奶制备菌液分装菌液预冻真空干燥封管。-70C冰箱保存，时间可达1年。4.4 菌种保存用培养基4.4.1 土豆汁的制备取i二皮土豆50饵，水1000ml，切片煮沸1h，走容至1000ml，取上j青液备用。4.4.2 固体培养基制备取土豆计七洁液1000ml，分别加入蛋白陈1%、葡萄糖1%、酵母浸膏。.1%、磷酸氢二饵O.1%、硫酸馍O. 02%、琼脂1.8%2%。煮沸溶化，用1N的盐酸或1N氢氧化铀调制PH6.7，后分装于试管内(中试管每支约6ml7ml) 115C、0.075MPa灭菌30min后取阳，摆成斜由各用。4.4.3 液体培养基制备2 DB63/T 863-2009 取土豆汁上沽液1000ml，分别加入蛋白陈1%、葡萄糖1%、酵母浸膏。.1%、磷酸氢甲O.1%、硫酸镇O. 02%，煮沸溶化，用1N的盐酸或1N氢氧化饷调制PH6.7，后分装于250m1三角瓶内(每瓶装150m1)。115C、O.075MPa灭茵30min后取出备用。4. 5 冬虫夏草真菌的保存步骤4.5.1 准备工件4. 5. 2 升柔消毒液的配制准确称职0.lgHgCl2加少许蒸馆水溶解后用蒸馆水定容至100mL4. 5. 3 消毒灭菌4.5.3.1 分菌工作前用有效氯含量为1.1%1.3%的消毒打支将分菌环境喷事消毒。4. 5. 3. 2 将分菌用的医用手术川、医用小:蚂川、接种铲、接种针、9cm培养m用柔性较好的纸张包扎好后，至于121C、O.1MPa条件下灭菌30min后取出，放入超净工作台内备用C4. 5. 3. 3 将己制备灭菌好的培养基试管放入超净工作台内，打开超净工作台内的紫外灯，肝、射30min 后关闭紫外灯的电源。5 菌种转移5. 1 固体培养基转移按照无菌操作的要求，将纯化好的固体培养基上的菌种，挑取少量菌丝接种在保存用斜面培养基内，用无菌胶塞封口，10C15C条件下培养。5. 2 液体培养基转移按照无菌操作的要求，用10日11的无菌吸管吸取二角瓶内纯化好的菌丝球，接种在保存用液体培养基内，用胶塞力口石蜡封试管口，作为保存南丰111备用。6 保存菌种的复壮需要使用商种，复活培养时，需在无商条件下打开保存的试管，取部分南种于4.4. 2的斜面培养基上，长出南落后再转接一次，或者接种到4.4.3的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。进行显微镜检查，镜检力法见实验室冬虫夏草真甫一一中国被毛由分离技术规程。3