DB34∕T 2560-2015 窖泥微生物群落结构快速定量测定 PSP-qPCR绝对定量法.pdf

ICS 01.040.67 X 60 DB34 安徽省地方标准 DB 34/T 25602015 窖泥微生物群落结构快速定量测定PSP-qPCR 绝对定量法 Quickly detection methed to quantify pits mud microbial communities PSP-absolute qPCR method 文稿版次选择 2015 - 12 - 30 发布 2016 - 01 - 30 实施安徽省质量技术监督局 发 布 DB34/T 25602015 I 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限公司、安徽古井贡酒股份有限公司、哈尔滨工业大学。 本标准起草人：何宏魁、周庆伍、李安军、刘国英、余秀娟、汤有宏、葛向阳、张会敏、蒋军、聂加燕。DB34/T 25602015 1 窖泥微生物群落结构快速定量测定 PSP-qPCR 绝对定量法 1 范围 本标准规定了一种基于门特异性引物测定窖泥微生物群落结构组成的快速定量优化方法。 本标准适用于窖泥中微生物群落结构的快速定量检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 门特异性引物 phylum-specific primers，PSP 指特异性扩增某个门的所有微生物基因序列所共有且相对于其余门的微生物基因序列所独有的基因序列的引物对，由一条正向引物（53）和一条反向引物（35)组成。 3.2 荧光定量 PCR quantitative PCR，qPCR 又称 real-time PCR，荧光反转录-聚合酶链反应。 3.3 Ct 值 cycle threshold value 指 PCR 反应体系中目标 DNA 浓度达到人为确定的阈值时的 PCR 循环次数。 3.4 TA 克隆 TA Clone 是一种亚克隆方式，在连接酶存在的情况下，依赖DNA链两端的腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的互补作用，将不同 DNA 链连接。 4 原理 DB34/T 25602015 2 实时荧光 PCR 技术， 是指在 PCR 反应体系中加入荧光基团， 利用荧光信号积累实时监控整个 PCR过程。将标记有荧光素的 Taqman 探针与模板 DNA 混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板 DNA 互补配对的 Taqman 探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度， 求得 Ct 值， 进而根据未知样品的 Ct 值在标准曲线的位置得到未知样品中目标序列的初始拷贝浓度的方法。 采用 SAP 技术（单碱基差异原则）设计门特异性引物，在引物的 3端为单核苷酸多态性位点，当在引物 3末端倒数第二个碱基引入错配后，若最后一个碱基是强配对碱基，则此种情况下引物仍可以与模板配对并延伸。 5 试剂和材料 5.1 本标准中所用的水，除文中提到的 ddH2O 属于经过两次蒸馏的双蒸水以外，其他实验室用水均指符合 GB/T 6682 中要求的三级水。所述溶液，在未特别注明，均指水溶液。 5.2 土壤基因组 DNA 提取试剂盒。 5.3 胶回收试剂盒。 注：胶回收试剂盒是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。 5.4 TA 克隆试剂盒。 注：TA 克隆试剂盒是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。 5.5 大肠杆菌感受态细胞。 注：大肠杆菌感受态细胞是由相关试剂公司提供，可用不同公司的等效产品具有相同效果即可。 5.6 PCR 试剂盒。 5.7 qPCR 试剂盒。 5.8 质粒 DNA 提取试剂盒。 5.9 细菌 16S rDNA 扩增引物。 注：第 4 章中所述主要试剂提及几种试剂盒和试剂，由于不同品牌的试剂盒中试剂和操作步骤略有差异，根据各种试剂盒实际使用效果，为方便本标准的使用者，现对部分试剂盒给予常用供应商标注，供标准使用者参考。 6 仪器和设备 6.1 紫外核酸检测仪。 6.2 荧光定量 PCR 仪。 6.3 PCR 仪。 6.4 凝胶成像系统。 6.5 高速冷冻离心机。 6.6 冰盒。 6.7 移液枪。 6.8 八连管离心机。 7 测定步骤 7.1 门特异性引物设计 DB34/T 25602015 3 7.1.1 样品总 DNA 的提取、细菌 16S rDNA 的 PCR 扩增、克隆文库的构建及阳性克隆的筛选 提取窖泥样品中的基因组总 DNA （按 5.2 说明书的方法） ， 以此为模板扩增接近全长的 16S rDNA。选择扩增引物1， 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳， 将指定片段的条带切胶回收纯化 （按 5.3 说明书的方法） ，然后进行 TA 克隆（按 5.4 说明书的方法），连接产物进行转化（按 5.5 说明书方法），后进行蓝白斑筛选，获得一定数目的有效克隆2。 注1：扩增引物可以选择 27F（5- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3）和 1492R（5-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3），但不限于此。 注2：有效克隆在这里指最后的双向测序序列经过序列比对确实属于 16S rDNA 序列。 7.1.2 克隆测序、序列分析 有效克隆经过 DNA 测序，得到双向测序序列，利用拼接软件完成双向序列拼接，去掉来自克隆载体的多余序列。经过相应网站（见编制说明）的进行比对，确定与已知序列的同源关系。将结果相同的序列归为一个 OTU（Operational taxonomic unit）。 可进一步通过将各 OUT 的未知代表序列和已知标准菌的序列一起建立系统发育树的方式确认彼此之间的亲缘关系。 把相同的门归在一起，不同的门之间的序列差异通过 SAP 技术处理3，这些引物对以每个门的实际16S 序列的 TA 克隆纯质粒为模板进行 PCR（按 4.5 说明书的方法）验证及所有门混合模板验证，以及 qPCR （按 5.6 说明书的方法）验证，结果要求只扩增出来特异目的条带，Tm 值分析只有主带，且不含引物二聚体或极少二聚体，得到门特异性引物序列4。 注3：所述引物在 SAP 技术处理过程中，在某些引物的 3端倒数第二碱基引入人为错配，该错配不影响靶序列的扩增，却可以破坏非靶序列的扩增，增强了引物的特异性。 注4：得到的门特异性引物序列直接通过有关生物技术公司合成。 7.2 群落结构定量方法-PSP-qPCR 绝对定量法 注：由于不同 qPCR 定量测定涉及 qPCR 体系配制和程序设定，而不同 qPCR 试剂盒和不同 qPCR 仪在操作上会有所不同，本标准给出的方法较笼统，具体操作可参考附件C 中举例说明。 7.2.1 普通 PCR 引物筛选实验 a) 进行梯度 PCR，电泳。通过电泳，选择最佳退火温度，将产生引物二聚体的引物排除。 b) 选择出来的引物扩增对应门的 16S rDNA 序列和非对应门的 16S rDNA 序列。模板选择使用 TA克隆质粒。 选择能够正确扩增目标序列的引物 （选择引物的原则是所选引物能正确扩增目标序列，对非目标序列不扩增。若引物对目标序列正常扩增，对非目标序列有微弱的扩增，对此引物选择保留）。 7.2.2 qPCR 预实验 经普通 PCR 试验筛选出的 PSP 引物进行 qPCR 预实验5（按 5.7 说明书的方法）。 检查扩增曲线和溶解曲线。溶解曲线中，只有 PCR 产物所产生的峰，没有引物二聚体峰存在。同时做空白对照（以 ddH2O 为模板）和阴性对照6（以非目标质粒为模板），确保没有扩增曲线产生，即一直保持水平线，没有起峰，没有典型的对数生长期。另外，引物二聚体扩增峰典型得出现于空白对照中，尤其是扩增循环的后面几个循环。即这种情况下，实验样品扩增曲线和溶解曲线正常，空白对照的溶解曲线只有引物二聚体的峰, 阴性对照只有非目标产物峰或者引物二聚体峰。 注5：所述 qPCR 预实验是指只进行简单的 qPCR 试验，不需要配合使用标准品制作标准曲线。 DB34/T 25602015 4 注6：如果阴性对照出现了扩增曲线，非目标序列微弱扩增。在 qPCR 扩增曲线图谱中表现为阴性对照，即非正常扩增的目标产物的扩增曲线开始起峰的循环数少于正常样品的循环数。少于 35 个循环，选择保留，检测时，只要将 qPCR 检测程序设定为 35 个或稍少于 35 个循环即可。此外，如果发现某检测样品的 CT 值大于阴性对照，默认该样品的检测目标为 0。 7.2.3 质粒标准品的制备 质粒标准品可以是纯化后的 PCR 产物，也可以是含有 PCR 产物的质粒。本标准中选用含有 PCR产物的质粒。 具体制备过程参考附件B。 7.2.4 qPCR 体系的配制 7.2.4.1 qPCR 扩增体系 基因组模板（来自于样品中，记为 N 组）、引物（待测定门的特异性引物）、Taq DNA 聚合酶、qPCR 缓冲液（含dNTP和Mg2+）、ddH2O（灭菌）、制备好的质粒（用作qPCR标准品）。 7.2.4.2 质粒标准品的梯度稀释 1) 准备 10 个无菌的 1.5 mL 的离心管，每管中加入 18 L 的双蒸水，吸取质粒原液 2 L 加入到第 1 管中，然后用手指弹匀，离心甩下来（转速达到 5000 rpm 立即停止）；再弹匀甩下来，这样每个稀释液弹匀离心两次，得到 10-1稀释液。 2) 再在第一个管子中吸取 2 L 到第 2 管中，如前操作，得到 10-2稀释液。 3) 如操作 1）、2），计稀释 8 个梯度，即梯度稀释至 10-8。 4) 然后使用最后 6 个梯度进行 QPCR 定量，舍掉 10-1和 10-2 两个梯度。 注：稀释的梯度和稀释倍数可根据实际需要而定，不限于以上所述。根据经验，对于微生物门的质粒梯度一般稀释8 个梯度， 梯度稀释一般选择 10 倍稀释。 最终用来制作标准曲线的稀释点取决于被检测未知样品的浓度范围，最好是保证未知样品的浓度点位于标准曲线的直线范围。 7.2.4.3 qPCR 体系的配制 qPCR 体系的配制包括标准品和未知样品的配制。 其中： Mix是不含模板的所有 qPCR 试剂的混合物（包括 qPCR buffer（含荧光物质）、Primers、TaqDNA 聚合酶、ddH2O）； Mix是包含 Mix和样品各自模板混合物。 a) 配制标准品 Mix 首先计算配制 Mix 的管数： 实验组数： 比如说，某试验需要 6 个梯度稀释的标准品做标准曲线，测一个未知样品的浓度，同时试验中设置一个阴性对照。 6 组梯度+1 组基因组+1 NTC （对照） =8 组； 每组实验 3 个平行， 故计需配制组数 N=（8+1）（3+1）=36管2。所以，配置 Mix的时候需要配相当于 36 管的试验量的 Mix。 注：为方便具有足够的 Mix配置 Mix，一般配制多一倍组的所需体积的 Mix。多出来的 1 倍量用于弥补配置 Mix粘到管壁上的损失和稍后配置 Mix 粘在移液枪头上的损失。此处为经验值，因为 Mix 为一个样品的 3 次重复实验的实验液的量。 DB34/T 25602015 5 按 5.7 说明书，配制 12 L 体系（12 L 体系不是不可更改的，可按照试验要求，按照比例更改试验体系的体积为 25 L 或者 50 L），如表1： 表1 PCR 扩增体系 ddH2O： 3.2 L 36= 115.2 L qPCR buffer（含荧光物质） 6.0 L 36= 216 L Primers： 1.6 L 36= 57.6 L Taq 酶： 0.2 L 36= 7.2 L 基因组： 单加1 L b) 配制标准品 Mix 准备 8 个无菌的 1.5 mL 的离心管，用于配制 8 组反应液。按 5.7 说明书，配制 12 L 体系，如表2： 表2 12LPCR 扩增体系 Mix ： 11L 3.5= 38.5L 基因组模板： 1L 3.5= 3.5L 注：表1中，配置 Mix 的时候，三次重复试验的以4 进行计算，而表2 中使用 Mix 配置Mix 时，三次重复试验按照3.5 进行计算，以这种方式给与液体转移足够的液体损失空间。等最终上样的时候按照准确的3 进行加样，即每管 12 L 的加液量。 c) 八连管分装 按表3 位置分装：（注：表3 所图示为 ABI-Stepone 48 孔 qPCR 仪器的排布，实际试验中根据所使用的仪器型号可能排布方式不同，只要保证 qPCR 仪器程序设置的顺序和加样顺序一致即可。） 表3 八连管分装位点 S-10 S-10 S-10 S-9 S-9 S-9 S-8 S-8 S-8 S-7 S-7 S-7 S-6 S-6 S-6 S-5 S-5 S-5 N N N NTC NTC NTC S-10 S-10 S-10 S-9 S-9 S-9 S-8 S-8 S-8 S-7 S-7 S-7 S-6 S-6 S-6 S-5 S-5 S-5 N N N NTC NTC NTC 注1：S-5S-10：选择的 6 个稀释梯度； 注2：N、N：待测样品，不限于两个； 注3：NTC：阴性对照。 7.2.5 qPCR 程序的设定与运行 PCR 扩增程序分为扩增曲线部分和溶解曲线部分，具体程序设定方法参考附件C。 注：本标准 qPCR 扩增程序采用荧光染料方法， 故分为扩增曲线部分和溶解曲线部分。 如果使用 TaqMan 探针方法，则只有扩增曲线部分。实际操作中由于用 TaqMan 探针方法，价格昂贵，一般不使用。 7.2.6 通过溶解曲线确认产物的正确性 DB34/T 25602015 6 在方法建立过程中， 扩增产物的纯度和质量要通过琼脂糖凝胶电泳检测。 扩增条件优化后实际进行测定时无需每次再进行产物的检测； 通过观察溶解曲线， 如果没有出现引物二聚体峰， 扩增产物峰单一，并且产物 Tm 值与标准品的 Tm 值一致即可。 7.2.7 优化标准曲线 通过选择标准曲线中合适的标准品的梯度稀释点，以及调整 Ct 值，阈值等参数，保证标准曲线的参数 R2 值大于 0.99。 7.2.8 结果计算 在标准曲线上根据未知浓度样品的 Ct 值得到对应的浓度值。 DB34/T 25602015 7 A A 附 录 A （资料性附录） 细菌 16S rDNA PCR 扩增产物的获取实例 A.1 引物选择 扩增引物为细菌 16S rDNA 的通用引物：27F （5- AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3）和 1492R （5-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3）。 A.2 建立PCR反应体系 使用 PCR 试剂盒根据各自比例关系添加各成分，如： PCR 反应 12 L 体系：6 L 2PCR buffer、1 L (1050 ng )DNA 模板、0.8 L each primer (2 M)、0.2 L Taq DNA polymerase (5 U/L)、 4 LddH2O。 A.3 设定PCR 反应程序 根据引物的退火温度和 PCR 产物的长度，设定 PCR 反应程序，如： PCR 反应程序1：94预变性 5 min、94 30 s、55 30 s、72 30 s，38 个循环，72完全延伸 5 min。得到 PCR 扩增产物。 注1：以上程序供参考，实际试验过程中，根据引物的退火温度设定退火温度，根据 PCR 产物的长度设定扩增时间，对于 qPCR 来说，其 PCR 产物长度一般不会长于 500 bp，设置 30S 已经足够。 DB34/T 25602015 8 B B 附 录 B （资料性附录） 质粒标准品的制备方法 B.1 将作为 PCR 标准品的 PCR 产物，扩增后，电泳，切胶纯化。 B.2 通过 TA 克隆将纯化后的 PCR 产物跑电泳照相，确认其浓度足够。 B.3 质粒转化：配置载体连接体系：Vetor（pMDR-19T，Takara） ：0.5 L；纯化的 PCR 产物片段2.5 L；Solution I：3 L（务必保证前两者的体积之和等于 Solution I 的体积） 。混匀后室温放置连接 1-4 个小时。 注：以上试剂来自于试剂盒 pMD19-T Code D102A，如果 DNA 产物浓度很大，可以稀释后再按比例连接。 B.4 连接完后，转入感受态大肠杆菌 DH5 中。 （可以查看相关产品说明书） 1) 将连接好的 6 L 质粒首先在冰水混合物中预冷，然后向其中加入 40 L 的感受态细胞。 2) 冰上放置 40 min，42培养 5 min。 3) 之后加入 1 mL LB 培养基液体，37振荡培养 45 min。 4) 培养完毕后倒板。平板为 LBA 培养基又加上了 X-gal（40 L，20 mg/mL，2）和 IPTG（70 L，20 mg/mL，2）两种抗生素。其中设计阴性对照，阴性对照只需将感受态细胞经历相同的操作后，在不添加抗生素的 LBA 平板上进行倒板就可以了。两个样品在 4个板上依次涂布 50L，150 L，300 L，500 L。（备注：此处设置不同的涂布体积是为了保证得到适于挑取单菌落的平板， 避免单菌落彼此类似于草丛连接分布而无法挑取单菌落，或者菌落数量太少得不到足够的单菌落。） 5) 铺好的板，等完全晾干后，于 37过夜培养。培养大约 16 个小时后观察结果。 B.5 通过蓝白斑筛选挑取白斑即是转化成功的细胞。 B.6 转化成功率验证：由于凡是转化都存在成功率的问题，故需要进行验证。 验证方法有两种： a) 使用质粒提取试剂盒提取质粒然后酶切验证，可以使用 HindIII and EcoRI 组合 37酶切 2小时，然后跑电泳确认的方式验证。如果连接正确的话，应该有两条带，上带应该是纯质粒，大小是 2692 bp，下带就是连接产物的大小，根据下带确定连接体的大小正确与否。 b) 做菌液 PCR，直接把很少的白斑菌挑出来，挑到 50 L 无菌水中，沸水煮 3 min，12000 rpm离心 5 min 取上清 1 L 做模板进行 PCR 看产物大小。此方法不会百分百确定，但可以做一个快速的筛选。 B.7 提取质粒，测定质粒浓度和质量，测量浓度的同时，通过 Abs260/Abs280 的比值可以看出质粒的质量，在 1.8 最好，在 1.7-1.9 之间即可做标准品了。 DB34/T 25602015 9 B.8 质粒标准品浓度计算公式： 样品浓度（Copy/L）= . (B.1) 式中： 6.021023 1 mol DNA分子拷贝数，单位为 copy/mol。 DNAconcentration 质粒标准品浓度，单位为 g/L。 DNA lengh 质粒标准品的总长度，单位为 bp。 660 个碱基对的平均分子量是 660，单位为 daltons/bp。 660DNArationDNAconcent1002. 6length23DB34/T 25602015 10 C C 附 录 C （资料性附录） qPCR 体系配制与程序设定实例 C.1 选择样本 在同一地点平行取 4 个样品，并编号，混合。按表C.1 的方法记录混合样品。 表C.1 样品编号 混合样品 样品编号 混合样品 A ABCD G GIJL B I C L D J F EFHK M MNOP E O K N H P C.2 qPCR 体系配制 C.2.1 12 L 实验体系为（12 L 试验体系并不是固定不变的，通常如果试验量小的话，25 L 体系和 50 L 体系使用比较多；在本试验中由于试验量比较大，改为 12 L 体系，以节省成本。如果想改试验体系的话，各成分按比例修改即可。不过 Taq 酶的用量一般按照比例增大后须适当减少，因为过量的 Taq 酶容易导致二聚体的产生，以及错配的产生，缺少部分用 ddH2O 补齐即可。 ） ：见表C.2。 表C.2 反应体系 体积 /L qPCR buffer（含荧光物质） 6.0 ddH2O 3.2 Primers（门特异性引物） 1.6 Taq 0.2 DNA 模板 1.0 其中质粒标准品设置 7 个梯度，为 10-410-10。 QPCR 程序：95-5 min；（95-30S-65-35S-72-35S）45；72-5 min。 C.2.2 引物：使用特别设计的门特异性引物。 C.2.3 标准样品：N 个门各自的质粒作为各自标准品。N 个门分别单独完成 qPCR 实验。 以拟杆菌门为例数据提供如下： DB34/T 25602015 11 对 Bacteroidetes 门特异性引物进行绝对定量 Q-PCR 检测与分析，4 个混合样本的编号是 ABCD EFHK GIHK MNOP ，Bacteroidetes 门对应的特异性引物是 302-321 C.3 实验过程 C.3.1 Bacteroidetes 门质粒梯度稀释：-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8（-1、-2 稀释后舍去） （此处只是一个实验举例，-1、-2 稀释梯度舍去的原因是因为 -3-8 稀释梯度范围正好可以覆盖待检测未知样品的浓度范围。所以，要具体实验情况具体分析。 ） 各管加 18 L 的 ddH2O。见表C.3。 表C.3 编号 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 ddH2O/L 18 18 18 18 18 18 18 18 梯度稀释 2 L 2 L 2 L 2 L 2 L 2 L 2 L 浓度依次稀释 10 倍，是原来浓度的 110；每次添加后均涡旋离心 2 次。 C.3.2 配制 Mix：(12 L 体系) -3-8（6 个） 。见表C.4。 表C.4 ddH2O： 3.2 L 45= 144 L qPCR buffer（含荧光物质） 6.0 L 45= 270 L Primers（门特异性引物） 1.6 L 45= 72 L Taq 酶： 0.2 L 45= 79 L 基因组模板： 单加1L 注：实验组数为 11 组：6 个梯度+ 4 组基因组 + 1 个NTC，每组 3 个平行，所需管数 45 管：（11+1）（3+1），人为加上 1 管，为了加样方便凑个整数。 加完 Taq 酶后涡旋离心 2 次。 C.3.3 配制 Mix： 见表C.5。 表C.5 Mix 11 L 3.5= 38.5L 基因组模板： 1 L 3.5= 3.5L 以上操作均要在冰浴中进行。11 个样品均涡旋离心 2 次。 注：此处 Mix 的配置是基于 Mix的基础上的，配 Mix的时候，3 个平行试验预留了 4 管的加液量，考虑到加液损耗，到这一步每个 Mix 按照 3.5 的量添加，最终实际（C.3.4）上样的时候，每个样品添加 12 L3，这样保证了最终添加量的准确。 C.3.4 八联管上样 (备注:图示是 ABI-Stepone 48 孔 QPCR 仪上样图示。试验中，上样位置并不是很重要，只要上样方便，不过务必保证各管的“程序设置”与实际摆放一致。) DB34/T 25602015 12 见表C.6。 表C.6 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7 7 7 8 8 8 NTC NTC 注1：3-8：梯度稀释倍数； 注2：-：基因组模板； 注3：NTC：阴性对照。 C.4 qPCR 程序设定举例 按照设定好的 step-one QPCR 程序进行实验并导出定量标准曲线。 扩增曲线基本程序如下： 95 4 min 完全变性 95 30 s 变性 65 30 s 退火 45 cycles 72 35 s 延伸 72 5 min 完全延伸 溶解 Tm 曲线程序： 95 15 s60；601 min （+0.3）9515 s。 注：根据溶解曲线和标准曲线做结果分析与计算。 _