SN∕T 5368.1-2022 商品化试剂盒检测方法 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌） 方法一.pdf

I C S0 7. 1 0 0. 3 0C C SX0 4中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T5 3 6 8. 12 0 2 2 商品化试剂盒检测方法克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 方法一C o mm e r c i a l K i t D e t e c t i o n M e t h o d -C r o n o b a c t e r s p p.(E n t e r o b a c t e r s a k a z a k i i) T e s t m e t h o d 2 0 2 2 - 0 3 - 1 4发布2 0 2 2 - 1 0 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1. 12 0 2 0 标准化工作导则 第1部分: 标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。本文件是S N/T 5 3 6 8 商品化试剂盒检测方法 克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 的第1部分。S N/T 5 3 6 8已经发布了以下部分: 商品化试剂盒检测方法 克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 方法一。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位: 中国海关科学技术研究中心、 中华人民共和国石家庄海关、 中华人民共和国福州海关、 中华人民共和国拱北海关、 中华人民共和国深圳海关。 本文件主要起草人: 曾静、 张西萌、 张琳、 徐蕾蕊、 马丹、 郑晶、 冯家望、 吕敬章。S N/T5 3 6 8. 12 0 2 2商品化试剂盒检测方法克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 方法一1 范围 本文件规定了食品中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 的环介导恒温核酸扩增(l o o p - m e d i a t e d i s o t h e r -m a l a m p l i f i c a t i o n,L AMP) 检测方法。 本文件适用于食品中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 G B 4 7 8 9. 4 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 检验 G B 1 9 4 8 9 实验室 生物安全通用要求 G B/T 2 7 4 0 3 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 S N/T 2 7 7 5 商品化食品检测试剂盒评价方法 S N/T 3 2 6 6 食品微生物检验方法确认技术规范3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全和防止污染, 应由具备资格的工作人员检测克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 。所有培养物、D NA提取物和废弃物应按照G B 1 9 4 8 9和G B/T 2 7 4 0 3中的有关规定执行。5 技术概要 应用环介导恒温核酸扩增(L AMP) 技术进行克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 的筛选检测。根据克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 特有靶序列上的6个独立区域, 采用6条特异引物通过稳定的B s t D NA聚合酶来驱动扩增反应, 在6 0 左右完成恒温扩增。在环介导恒温核酸扩增反应中, 焦磷酸盐(P P i) 通过AT P -硫酸化酶被转化成三磷酸腺苷(AT P) 。荧光素酶利用AT P发光, 实现实时检测。6 试剂与材料6. 1 3 M MD S克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 分子检测试剂盒, 本试剂盒参考S N/T 2 7 7 5和S N/T 3 2 6 6由国家认证认可监督管理委员会商品化食品检测试剂盒评价专家委员会组织评价。具体评价结果参见1S N/T5 3 6 8. 12 0 2 2附录A。试剂盒组成如下:a) 裂解溶液( 透明管中的粉红溶液 L S管) ;b) 扩增试剂管( 含有冻干试剂小球, 橙红色试管) ;c) 阳性对照(R C) ;d) 盖子( 橙红色盖) 。注: 如商品化试剂盒关键技术指标发生变动时, 以试剂盒说明书操作为准。6. 2 克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 质控菌株:AT C C 2 9 5 4 4。6. 3 缓冲蛋白胨水(B PW) 培养基: 按照附录B。6. 4 3% 8 4消毒液。7 仪器和设备除微生物实验室常规灭菌及培养设备外, 其他设备和材料如下: a) 恒温培养箱:3 6 1 ;b) 天平: 感量0. 1 g;c) 无菌锥形瓶:2 0 0 0 mL;d) 移液器: 量程1 0 L1 0 0 L;e) 加热模块:1 0 0 1 ;f) 3 M分子检测仪;g) 计时器。8 检测程序 食品中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌)L AMP检测程序见图1。2S N/T5 3 6 8. 12 0 2 2图1 食品中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌)L AMP检测程序9 操作步骤9. 1 样品制备、 增菌培养 以无菌操作取样品1 0 0 g (mL) 置灭菌锥形瓶中, 加入9 0 0 mL预热至4 4 的B PW培养基中, 用手缓缓地摇动至充分溶解, 在3 6 1 条件下培养1 8 h2 h。9. 2 细菌模板D N A的制备( 裂解)9. 2. 1 将裂解溶液(L S) 管的温度平衡到室温, 混合均匀。9. 2. 2 用移液器从8. 1获得的B PW增菌液吸取2 0 L转移到L S裂解管内。9. 2. 3 当3 M分子检测加热模块的温度达到1 0 0 1 时, 将无盖L S管架放在加热模块中加热1 5 m i n1 m i n,L S将从粉红( 冷) 变为黄色( 热) 。9. 2. 4 从加热模块中取出L S管架, 将其放在冷却架冷却5 m i n1 0 m i n至L S恢复为粉红色。9. 3 环介导恒温核酸扩增(L AMP) 反应9. 3. 1 阴性对照、 阳性对照设置 每次反应必须设置阴性对照和阳性对照。阴性对照以无菌增菌培养基(B PW) 替代D NA模板, 请勿将水用作阴性对照。阳性对照为试剂盒提供的R C。3S N/T5 3 6 8. 12 0 2 29. 3. 2 扩增过程9. 3. 2. 1 吸取L S管中D NA模板2 0 L, 至扩增试剂管( 含有冻干试剂小球) , 成一定角度缓慢加入, 以避免搅动小球, 轻轻上下吹吸5次, 使小球溶解并充分混匀, 加盖橙红色盖子并确保盖子盖紧。9. 3. 2. 2 D NA模板添加顺序应为: 待测样品、 阴性对照和阳性对照, 以避免交叉污染。9. 3. 2. 3 将反应管装进3 M分子检测快速转移托盘, 关闭并锁定托盘盖。9. 3. 2. 4 在3 M分子检测软件中查看和确认配置的检测, 在软件中单击启动按钮, 仪器盖自动打开。9. 3. 2. 5 将3 M分子检测快速转移托盘放入3 M分子检测仪器并关闭盖, 启动分析。9. 3. 2. 6 为了避免因为交叉污染而导致的假阳性结果, 在分析完成后, 将快速转移托盘浸入3% 8 4消毒液1 h, 且始终远离分析准备区。9. 4 结果观察 6 0 m i n完成扩增, 仪器实时自动报告检测结果, 具体结果参见附录A的A. 2。1 0 结果报告1 0. 1 在阴性对照和阳性对照结果均有效的情况下: 待测样品检测结果呈阳性, 对样品增菌液进一步按照G B 4 7 8 9. 4 0中操作步骤进行确认后报告结果; 待测样品检测结果呈阴性, 报告未检出克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 。检测结果示意图参见附录C的图C. 1。1 0. 2 若与上述条件不符, 则本次结果无效, 应更换试剂按本方法重新检测。4S N/T5 3 6 8. 12 0 2 2附 录 A( 资料性)3 M MD S克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 检测试剂盒评价结果1)A. 1 包容性和排他性 选择1 0 1株经确认的克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 标准菌株和分离菌株, 用3 M MD S克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 试剂盒方法进行测试, 结果全部为阳性。 选择3 0株经确认的非克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 的标准菌株, 用试剂盒方法进行测试, 结果全部为阴性。A. 2 准确度、 特异性、 灵敏度及检出限 选择5个食品种类,1 5个食品类型的样品, 采用人工污染的方式分别制备未接种(L 0) 、 低(L 1) 、 高(L 2) 三个污染水平试验样品, 分别用3 M MD S试剂盒方法和G B 4 7 8 9. 4 0方法进行测试, 相对准确度、特异性、 灵敏度及检出限结果如表A. 1。表A. 1 灵敏度、 特异性、 准确度及检出限序号食品基质相对准确度A C相对特异性S P相对灵敏度S E检出限(C F U/g)1饼干1 0 0%1 0 0%1 0 0%0. 0 9 12婴儿奶粉9 9%9 7%1 0 0%0. 0 9 1 3婴儿辅食1 0 0%1 0 0%1 0 0%0. 0 9 1 4冷冻饮品9 7%1 0 0%9 5%0. 0 9 1 5奶制品1 0 0%1 0 0%1 0 0% 0. 0 9 1A. 3 耐变性 分别对增菌时间( 正常设置为1 8 h) 、 裂解时间( 正常设置为1 5 m i n) 和反应体积( 正常设置为2 0 L) 三个变量进行耐变性实验, 检测结果表明, 在裂解时间变化2 m i n、 裂解体积变化2 L和反应体积变化2 L的情况下, 对克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 分子检测试剂盒方法的检出率没有影响。A. 4 批间变异 取3个不同批号试剂盒分别对含目标菌和非目标菌样品进行批间差异实验, 检测结果表明, 该试剂盒无显著性批间差异。A. 5 评价结论 试剂盒方法检测结果与参考标准方法检测结果无显著差异, 能满足食品样品的检测要求。 1) 本评价结果仅适用于3M MD S 克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 分子检测试剂盒。5S N/T5 3 6 8. 12 0 2 2附 录 B( 规范性)培养基和试剂 缓冲蛋白胨水(B PW) 的成分和制法如下:a) 成分蛋白胨 1 0. 0 g氯化钠 5. 0 g磷酸氢二钠( 含1 2个结晶水) 9. 0 g磷酸二氢钾 1. 5 g蒸馏水 1 0 0 0 mLb) 制法将各成分加入蒸馏水中, 搅混均匀, 静置约1 0 m i n, 煮沸溶解, 调节p H至7. 20. 2, 于高压灭菌1 2 1 ,1 5 m i n。6S N/T5 3 6 8. 12 0 2 2附 录 C( 资料性)检测结果示意图 检测结果示意图: 见图C. 1。 注: 红色+为阳性结果, 绿色-为阴性结果, 阳性对照R C, 阴性对照N C。图1 3 M MD S克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 仪器检测结果7S N/T5 3 6 8. 12 0 2 2220218635T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准商品化试剂盒检测方法克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 方法一S N/T 5 3 6 8. 12 0 2 2*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 3 0网址 www. c u s t o m s k b . c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0. 7 5 字数1 8千字2 0 2 2年 月第一版 2 0 2 2年 月第一次印刷印数 1 *书号: 1 5 5 1 7 57 0 2 定价1 2. 0 0元