DB51∕T 2576-2019 柳桉组织培养育苗技术规程(四川省).pdf

ICS 65.020.40 B 61 DB51 四川省地方标准 DB51/T 25762019 柳桉组织培养育苗技术规程 2019 - 04 - 16 发布 2019 - 05 - 01 实施四川省市场监督管理局 发 布 DB51/T 25762019 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 培养基配制 . 1 4 接种 . 2 5 初代培养 . 3 6 启动培养 . 4 7 增殖培养 . 4 8 生根培养 . 5 9 炼苗 . 5 10 洗苗 . 5 11 苗木移栽和管理 . 5 12 苗木出圃 . 6 附录 A（资料性附录） 柳桉组织培养培养基配方 . 7 附录 B（资料性附录） 柳桉苗木质量等级表 . 8 DB51/T 25762019 II 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则的规定编写。 本标准由四川省林业和草原局提出并归口。 本标准由四川省市场监督管理局批准。 本标准起草单位：四川省林业科学研究院。 本标准主要起草人：郭洪英、黄振、李佳蔓、陈炙、辜云杰。 DB51/T 25762019 1 柳桉组织培养育苗技术规程 1 范围 本标准规定了柳桉(Eucalyptus Saligna)组织培养育苗技术的培养基配置、接种、初代培养、启动培养、增殖培养、生根培养、炼苗、洗苗、移栽管理和出圃等技术流程。 本标准适用于柳桉在四川省内的组织培养育苗生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 6000 主要造林树种苗木质量分级 LY/T 1770-2008 桉树无性系组培快繁技术规程 LY/T 1882-2010 林木组织培养育苗技术规程 3 培养基配制 3.1 培养基选择 柳桉组织培养在不同阶段使用的培养基见附录A。 3.2 母液配制 3.2.1 水质要求 母液配制应使用蒸馏水、去离子水或超纯水。 3.2.2 大量元素配制 按照LY/T 1770-2008配制。 3.2.3 植物生长调节剂母液的配制 植物生长调节剂母液浓度宜配成0.1 mg/mL1 mg/mL。 3.2.4 保存 母液容器上应当贴上标签，备注上名称、配制日期、浓度倍数。配制好的母液应置于4的冰箱中冷藏保存。微量元素宜用棕色瓶保存。母液配制后应及时使用，贮藏时间不宜超过3个月。如发现有絮状物或沉淀产生应停止使用。 3.3 培养基制作 3.3.1 母液吸取 DB51/T 25762019 2 按比例吸取母液放入烧杯中，加入蔗糖、卡拉胶和激素后，充分加热溶解并定容。 3.3.2 pH 调节 用1.0 molL HCl或1.0 molL NaOH调节培养基pH 6.00.2。 3.3.3 培养基分装 将未凝固培养基倒入240 mL培养瓶并封口，培养瓶介质为玻璃或塑料。 3.4 培养基灭菌 具体操作参照LY/T 1882-2010。 3.5 培养基储存 灭菌后的培养基应注明编号和配置日期， 按用途和时间顺序分别置于培养基储藏室内， 储藏室内干净无风、温度20 ，储存时间不应超过30 d。 4 接种 4.1 准备工作 4.1.1 人员准备 接种人员在进入接种室前应在缓冲间穿着专用工作服、拖鞋，佩戴口罩、帽子，接种前用75%乙醇擦拭双手。 4.1.2 器具准备 接种所用的盘子、镊子、剪刀等器具应先用布袋、报纸包裹，放置在高压灭菌锅内灭菌后再使用，灭菌条件同3.4。 4.1.3 设备准备 开启工作台紫外灯15 min20 min，期间禁止人员进入接种室；关闭紫外灯后，开启超净工作台风机通风15 min后；用75%乙醇擦拭工作台台面和两边挡板。 若使用电热灭菌器应在接种前15 min将其开启。 4.1.4 培养瓶检查 对培养瓶进行检查，剔除污染、瓶裂、盖裂的培养瓶。 4.2 接种 4.2.1 器具消毒 将高温灭菌后的剪刀、镊子等器具用酒精灯或电热灭菌器再次高温处理，处理后应使其足够冷却，避免烫伤培养材料。 4.2.2 分株 DB51/T 25762019 3 在无菌接种盘中，用已冷却的工具将丛芽切分成小芽丛或单个茎段（茎段高度1 cm）后，将小芽丛或茎段接种至增殖培养基上，将1.5 cm的茎段接种到生根培养基上诱导生根。 4.2.3 接种密度要求 初代培养接种1个茎段/瓶，启动培养和增殖培养接种芽丛数812丛/瓶或茎段1520株/瓶，生根培养接种茎段30株/瓶。芽从或茎段均匀分布，叶片之间无重叠。 4.2.4 操作要求 每接种完一个培养瓶中的材料后，应擦净工具上的培养基，按4.2.1的方法将接种工具重新消毒一次，同时更换接种盘，避免交叉污染。 4.2.5 标注 接种后，应在培养器皿上标注接种日期、无性系编号、培养基编号、接种人员编号等信息。 4.2.6 接种后处理 熄灭酒精灯或关闭电热灭菌器，用含有75%乙醇的棉球擦拭清洁超级工作台，清洁接种室，最后关闭超净工作台电源。 5 初代培养 5.1 材料来源 采集外植体的母树应从引种栽培5年及5年以上的柳桉林分中择优选定。 优树具有以下特征：树干通直圆满，主干无明显分叉；冠幅较窄；年均胸径生长量4 cm或胸径候选林分平均胸径15%。 5.2 萌条采集 5.2.1 萌条要求 把优树伐倒或环割优树基部,选择伤口处再生的长50 cm70 cm、半木质化、无病虫害、健壮萌条。 5.2.2 萌条采集时期 宜在春季或夏季连晴3 d后的上午采集萌条。 5.2.3 萌条处理 用75%乙醇浸泡后的剪刀剪取萌条并修剪叶片， 仅萌条顶端保留2片4片叶。 萌条插入深度为5 cm10 cm无菌水的容器内。 采集萌条时，应标记每株优树的萌条，标明编号、采集地点、时间等。 若需运输，宜用保鲜膜完全包裹萌条，410低温保存。保存期不宜超过2 d。 5.3 外植体制备 5.3.1 清洗 DB51/T 25762019 4 材料取回后，把萌条剪成长度为5 cm带芽茎段。宜用中性洗洁剂溶液洗净带芽茎段表面，并在流动净水下冲洗0.5 h1 h后沥干备用。 5.3.2 消毒 在超净工作台中，用75%乙醇浸泡带芽茎段15 s20 s，无菌水冲洗3次；用0.1%HgCl2加3滴5滴表面活性剂吐温80浸泡带芽茎段5 min8 min， 期间应不断轻摇除掉气泡， 无菌水冲洗6次8次， 每次5 min。 宜用无菌吸水纸吸干带芽茎段表面水分，用无菌解剖刀或剪刀切成1 cm2.5 cm长、带有1个2个芽的外植体。 5.4 接种 应使用无菌镊子把外植体垂直或略倾斜接种到MS基本培养基上。 5.5 培养要求 培养室的温度应控制在252。接种后需暗培养5 d，再光照培养5 d7 d，光照时长12 h/d14 h/d，光照强度1500 lx2000 lx。7 d后，淘汰污染的外植体。 6 启动培养 6.1 腋芽诱导 将无菌外植体转入启动培养基中诱导腋芽萌发， 启动培养基见附录A， 附加0.2 mg/L0.3 mg/L 6-BA、0.08 mg/L0.1 mg/L NAA、0.12 mg/L0.18 mg/L IBA。 6.2 腋芽诱导培养条件 光照培养室白天温度宜为25 2， 夜晚为20 2。 光照时间12 h/d14 h/d， 光照强度1200 lx3000 lx，清晨9:00前，可在4000 lx5000 lx以下。增殖培养和生根培养条件相同。 7 增殖培养 7.1 增殖接种 将启动后的外植体剔除老叶和生长活力差的部分，接种到增殖培养基中，接种密度见4.2.3。增殖培养基见附录A，附加0.3 mg/L0.5 mg/L 6-BA、0.1 mg/L0.15 mg/L NAA、0.15 mg/L0.3 mg/L IBA。 7.2 质量要求 增殖的外植体应具备：叶色墨绿或灰绿，茎叶无玻璃化、白化、褐化；增殖系数大于2；茎叶切口无烫伤；无污染。 7.3 转瓶周期 每隔20 d25 d转瓶一次。 7.4 增殖培养时限 从外植体开始，培养时间超过4年，或增殖培养次数超过60次，应重新采集外植体更新培养材料。 DB51/T 25762019 5 8 生根培养 8.1 诱导生根 将长度1.5 cm的茎段丛分切为单个茎段，剔除基部老叶，保留茎段中部及以上3片完整真叶后，接种到生根培养基中。生根培养基见附录A，附加0.5 mg/L1 mg/L NAA、1.5 mg/L2 mg/L IBA。 8.2 质量要求 满足生根条件的茎段应具备：叶色墨绿或灰绿，茎叶无玻璃化、白化、褐化；茎叶切口无烫伤；无污染。 8.3 培养周期 生根培养的茎段10 d左右生出不定根成为瓶苗，出根后宜在光照培养室继续培养12周。 9 炼苗 9.1 炼苗条件 当瓶苗根长达5 mm10 mm、根数3条以上时即可炼苗。把瓶苗转移至炼苗温室或大棚。 9.2 炼苗时长 冬春季节，炼苗时间15 d25 d。夏秋季节，炼苗时间10 d15 d。 9.3 环境要求 炼苗期初采用强度在5000 lx以内的自然散射光， 环境温度1828， 3 d4 d后逐步拆除遮阳设施，缩小炼苗场所与自然环境温差。注意避免强光直射和高温灼伤瓶苗。 9.4 揭盖适应 移栽前2 d3 d应松开或打开培养瓶盖。 9.5 瓶苗质量要求 炼苗后，合格瓶苗应达到：平均苗高3 cm，苗高2 cm的苗数低于苗数的20%；平均根数3根；茎段和叶片上无愈伤组织；叶片翠绿不发黄。 10 洗苗 从培养瓶中取出幼苗，用清水洗净幼苗基部粘附的培养基，严禁撕扯根系。 11 苗木移栽和管理 11.1 基质准备 11.1.1 要求 DB51/T 25762019 6 基质由泥炭土和椰糠按1:3的体积配比混匀而成。基质用0.1%0.2%KMnO4淋透消毒后，薄膜覆盖保湿12 h，流水冲净即可填充至无纺布无底袋。 11.1.2 基质段规格 基质段由口径4 cm5.5 cm、袋高8 cm12 cm的无纺布无底袋和基质组成。将消毒后的基质装入基质段，压紧至底部不漏。 11.2 移栽 11.2.1 方法 用镊子在基质段中心部位掏直径2 cm、深5 cm的圆柱形孔，用镊子把幼苗放入孔内，根在孔内应舒展不弯曲，填入基质并压紧。 11.2.2 时节与场所 适宜移栽组培苗的季节有春季、初夏、晚秋和冬季，选择风小、阳光弱、空气湿度大的场所进行。宜避开高温季节。 11.3 轻基质容器苗管理 刚移栽的容器苗宜搭建遮阳网， 当光照强度0.1 cm；叶片颜色与生长正常，无青枯病、焦枯病，茎节无茎腐病；整株无枯萎病、大袋蛾、桉小卷蛾、葛氏长蛎盾蚧等检疫病虫害；苗茎具有一定的木质化程度。 12.2 分级 按照GB 6000方法测量苗高和地径。苗木分级见附录B。 12.3 包装与运输 按照LY/T 1770-2008进行包装与运输。 DB51/T 25762019 7 附 录 A （资料性附录） 柳桉组织培养培养基配方 表A.1 柳桉组织培养培养基配方 药品类别 药品名称 诱导培养基 （mg/L） 增殖培养基 （mg/L） 生根培养基 （mg/L） 大量元素 KNO3 950 1900 247 NH4NO3 825 1650 216 KH2PO4 139 278 432 MgSO47H2O 185 370 258 CaCl2 166 332 Ca(NO3)24H2O 250 微量元素 KI 0.83 0.83 H3BO3 6.2 6.2 6.2 MnSO4H2O 22.3 22.3 22.3 ZnSO47H2O 8.6 8.6 8.6 CuSO45H2O 0.025 0.025 0.025 Na2MoO42H2O 0.25 0.25 0.25 Na2SO4 5 有机营养成分 肌醇 100 100 60 VB6 0.24 0.24 0.24 生物素 0.12 0.12 0.072 VB3 1.25 1.25 0.75 甘氨酸 0.48 0.48 0.288 VC 1.25 1.25 0.8 L-半胱氨酸 5 5 1 核黄素 8 8 D-泛酸钙 0.8 0.8 0.48 铁盐 FeSO47H2O 27.8 27.8 27.8 Na2-EDTA 37.3 37.3 37.3 糖 蔗糖 30 000 30 000 15 000 凝固剂 卡拉胶 6 000 6 000 6 000 注：FeSO47H2O应先与Na2-EDTA配制成络合物，在做培养基时添加。 DB51/T 25762019 8 附 录 B （资料性附录） 柳桉苗木质量等级 表 B.1 柳桉苗木质量等级 树种名称 苗木类别 苗龄 苗木等级 综合控制指标 、级苗百分率级苗 级苗 地径 （cm） 苗高 （cm） 地径 （cm） 苗高 （cm） 色泽正常，无损伤 65 柳桉 Eucalyptus Saligna 组培容器苗 0.25-0 0.20 30 0.100.20 2030 色泽正常，无损伤 80 _