1、ICS 11.220 B 42 DB13 河北省地方标准 DB 13/T 28942018 动物尿液中苯乙醇胺 A 的测定 酶联免疫吸附法 2018 - 12 - 13 发布 2018 - 12 - 31 实施 河北省市场监督管理局 发 布 DB13/T 28942018 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由河北省农业厅提出。 本标准起草单位:河北省科学院生物研究所、河北省兽药监察所、石家庄市畜产品质量监测中心。 本标准主要起草人:李春生、米振杰、李云、刘静静、赵义良、杜顺丰、吴萌、王振来、张静。DB13/T 28942018 1 动物尿液中苯乙醇胺 A
2、 的测定 酶联免疫吸附法 1 范围 本标准规定了动物尿液中苯乙醇胺A的测定 酶联免疫吸附法的原理、试剂和材料、仪器和设备、样品处理、测定、结果计算、检出限、准确度、精密度、确证试验等要求。 本标准适用于动物尿液中苯乙醇胺A的快速筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规则和试验方法 GB/T 33411 酶联免疫分析试剂盒通则 NY/T 3146 动物尿液中22种-受体激动剂的测定 液相色谱-串联质谱法 3 原理 采
3、用酶联免疫吸附法, 在微孔条上包被偶联抗原, 样本中的苯乙醇胺A与酶标板上的偶联抗原竞争苯乙醇胺A抗体,加酶标记的抗体后,显色剂显色,终止液终止反应。用酶标仪在450 nm处测定吸光度,吸光度值与苯乙醇胺A含量成负相关,与标准曲线比较即可得出苯乙醇胺A含量。 4 试剂和材料 以下所有的试剂,除特别注明外均为分析纯,水为符合GB/T 6682规定的二级水。 4.1 苯乙醇胺 A 酶联免疫吸附法试剂盒:应符合 GB/T 33411 的规定,组成见附录 A。 4.2 乙酸铵。 4.3 乙酸。 4.4 氢氧化钠。 4.5 乙酸乙酯。 4.6 氯化钠。 4.7 -盐酸葡萄糖醛苷酶。 4.8 芳基硫酸酯酶
4、。 4.9 苯乙醇胺 A 标准品。 DB13/T 28942018 2 4.10 乙酸铵缓冲液 (2 mol/L) : 称取乙酸铵 15.4 g, 溶解于 1000 mL 水中, 用适量乙酸调 pH 至 5.2。 4.11 氢氧化钠溶液 (5 mol/L):称取氢氧化钠 2 g,溶解于 10 mL 水中。 4.12 -盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶: -盐酸葡萄糖醛苷酶活性约 30 U/mL;芳基硫酸酯酶活性约 60 U/mL。 5 仪器和设备 5.1 分析天平:感量 0.1 g。 5.2 酶标仪:配备 450 nm 滤光片。 5.3 离心机:10 000 rpm。 5.4 旋涡混合器。 5.
5、5 恒温箱。 5.6 电热恒温振荡水槽。 5.7 氮吹仪。 5.8 pH 计。 5.9 微量移液器:50 L,100 L,200 L,1 000 L。 5.10 八道移液器:250 L。 6 样品处理 6.1 样品制备 动物尿液试样使用前放置室温,如有混浊,离心后取上清液备用,4保存。 6.2 酶解 准确量取5.0 mL试样(6.1)于50 mL离心管,加入乙酸铵缓冲液(4.10)0.5 mL,再加入-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶(4.12)50 L,旋涡混匀,于37下避光水浴振荡16 h。 6.3 提取 酶解后,用氢氧化钠溶液(4.11)调pH至9.80.2,加入乙酸乙酯(4.5)10 m
6、L,再加入固体氯化钠(4.6)1.5 g2 g饱和水相,旋涡混匀,10 000 rpm离心5 min,取上清液于另一50 mL离心管内。再用乙酸乙酯10 mL重复提取一次。合并上清液,50下氮气吹干,用乙酸铵溶液(4.10)5 mL溶解。取100 L定容液加入200 L样本稀释液,混匀后备用。 7 测定 7.1 使用前将试剂盒在室温下回温 1 h2 h,将所需的酶标板条插入板架中。 DB13/T 28942018 3 7.2 每孔依次加标准品或试样 50 L,再加抗体工作液 50 L,轻轻振荡混匀。用盖板膜盖板,置37 下反应 45 min。 7.3 倒出孔中液体,将酶标板倒置在吸水纸上拍打,
7、完全除去孔中的液体,每孔加 250 L 洗涤液,5 s 后倒掉孔中液体,拍干,重复洗涤三遍。 7.4 每孔加酶标记抗体工作液 100 L。用盖板膜盖板,置 37 下反应 30 min,重复 7.3。 7.5 底物液 A 液和 B 液按体积比 11 混匀后,每孔加 100 L,37下避光显色 15 min。 7.6 每孔加终止液 50 L,轻轻振荡混匀,放入酶标仪,450 nm 波长测定吸光度值。 8 结果计算 按公式(1)计算百分吸光度比值: %1000BBY(1) 式中: Y百分吸光度比值; B标准溶液或试样溶液的平均吸光度值; B0空白(零浓度的标准溶液)的平均吸光度值。 以百分吸光度比值
8、为纵坐标,以苯乙醇胺A标准品浓度( g/L)的对数(lg)为横坐标,绘制标准曲线。 将试样的百分吸光度比值代入标准曲线, 计算出溶液的浓度, 试样中苯乙醇胺A的浓度 ( g/L)按照公式(2)计算。 V VN NcVcVX X1 1 (2) 式中: X试样中的苯乙醇胺A的含量,单位为微克每升(g/L); c从标准曲线上得到的待测溶液中苯乙醇胺A的浓度,单位为微克每升(g/L); V1试样提取溶液体积,单位为毫升(mL); N试样稀释倍数; V试样的体积,单位为毫升(mL)。 9 检出限、准确度、精密度 9.1 检出限 本方法的检出限为0.2 g/L。 9.2 准确度 本方法在0.2 g/L2
9、g/L添加浓度水平上的回收率为80 %120 %。 9.3 精密度 本方法在0.2 g/L2 g/L浓度范围的添加回收实验,批内变异系数应20 %。 DB13/T 28942018 4 10 确证试验 如被测样品中检出苯乙醇胺A时,需要用质谱方法进行确证。 DB13/T 28942018 5 附 录 A (资料性附录) 苯乙醇胺 A 酶联免疫吸附法试剂盒组成 A.1 酶标板:规格为 12 条8 孔。 A.2 苯乙醇胺 A 系列标准溶液:0 g/L、0.1 g/L、0.3 g/L、0.9 g/L、2.7 g/L、8.1 g/L。 A.3 抗体工作液。 A.4 酶标记抗体工作液。 A.5 浓缩样本稀释液:使用前按说明书配制。 A.6 浓缩洗涤液:使用前按说明书配制。 A.7 底物液 A 液。 A.8 底物液 B 液。 A.9 终止液。