DB42∕T 1630-2021 玉米赤霉烯酮降解酶活力的测定(湖北省).pdf

ICS 65.120 CCS B 46 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 16302021 玉米赤霉烯酮降解酶活力的测定 Determination of enzyme activity of zearalenone-degrading enzyme 2020 - 12 - 30 发布 2021 - 02 - 28 实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 16302021 I 目次 前言 . II 引言 . III 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 1 5 试剂和材料 . 1 6 仪器和设备 . 2 7 酶活力的测定 . 2 通用要求 . 2 试样酶液的制备 . 2 高效液相色谱紫外检测法 . 2 高效液相色谱荧光检测法 . 3 8 试验数据处理 . 4 9 精密度 . 5 附录 A（资料性） ZHD 降解 ZEN 酶活测定 . 6 DB42/T 16302021 II 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖北大学提出。 本文件由湖北省农业厅归口。 本文件起草单位：湖北大学、中国农业科学院油料作物研究所。 本文件主要起草人：张桂敏，向腊，王美星，丁小霞。 本文件实施应用中的疑问， 可咨询湖北省农业厅， 联系电话： [phone]， 邮箱： HBSNAB；对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 湖 北 大 学 ， 联 系 电 话 ： 15872631229 ， 邮 箱 ：。DB42/T 16302021 III 引言 玉米赤霉烯酮降解酶活力的测定尚没有相关国家和行业标准，本文件的实施解决了玉米赤霉烯酮降解酶在行业中无标准可依的问题，有利于对玉米赤霉烯酮降解酶的开发与利用；同时，能促进真菌毒素脱毒技术的发展，对推动玉米赤霉烯酮降解酶在谷物饲料中脱毒的应用具有重要的意义。 本文件通过紫外检测器和荧光检测器两种方法来检测玉米赤霉烯酮降解酶的酶活力，两种方法的成熟度较高。荧光检测器灵敏性高，但只有少数实验室具备，不具有普遍性；而紫外检测器一般实验室都具备，更具有普遍性，更容易被广大企事业单位接受和实施。 DB42/T 16302021 1 玉米赤霉烯酮降解酶活力的测定 1 范围 本文件规定了玉米赤霉烯酮降解酶（zearalenone-degrading enzyme，英文缩写：ZHD）的活力检测方法。 本文件适用于玉米赤霉烯酮降解酶产品，最低检出量为0.2 U/g (U/mL)。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 玉米赤霉烯酮降解酶活力单位/ZHD 活力单位（U） ZHD activity unit 在37 、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为10 g/mL的玉米赤霉烯酮溶液中降解1 g玉米赤霉烯酮所需的酶量为一个玉米赤霉烯酮降解酶活力单位（U）。 4 原理 ZHD能降解底物玉米赤霉烯酮（zearalenone，英文缩写：ZEN），ZEN的降解量与ZHD的活性成正比。通过高效液相色谱检测反应前和反应后残留的ZEN含量，可以计算得出玉米赤霉烯酮降解酶ZHD活力单位。 5 试剂和材料 通用要求：除特殊说明外，所用的试剂均为分析纯，水应符合 GB/T 6682 中二级水的规定。 甲醇（CH3OH）：色谱纯。 乙腈（CH3CN）：色谱纯。 乙腈/水（60/40，v/v）：取 60 mL 乙腈加 40 mL 水。 乙腈/水/甲醇（46/46/8，v/v/v）：取 46 mL 乙腈，加 46 mL 水和 8 mL 甲醇。 微孔滤器：孔径 0.22 m，有机相。 玉米赤霉烯酮 ZEN 标准品：纯度99.0%。 玉米赤霉烯酮 ZEN 标准溶液： 准确称取 1 mg 的 ZEN 标准品， 用 1 mL 色谱级甲醇配成浓度为 1 mg/mL的标准储备液，充分混匀，现配现用。 DB42/T 16302021 2 磷酸氢二钠溶液（0.2 mol/L）：称取磷酸氢二钠 14.20 g，加水溶解，定容至 500 mL。 柠檬酸溶液（0.2 mol/L）：称取柠檬酸 19.21 g，加水溶解，定容至 500 mL。 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（0.2 mol/L，pH 5.5）：取 50 mL 0.2 mol/L 磷酸氢二钠溶液，用大约 18 mL 0.2 mol/L 柠檬酸溶液进行调节，用 pH 计测定使缓冲液 pH 为 5.5。 6 仪器和设备 高效液相色谱仪：带有紫外检测器或荧光检测器。 离心机：离心转速不低于 12000 r/min。 pH 计：精度为0.01。 天平：感量 0.1 mg。 恒温水浴锅：37 。 移液器：精度为 0.1 L。 秒表：每小时误差不超过 5 s。 分样筛：孔径为 0.25 mm。 7 酶活力的测定 通用要求 本文件通过测定ZEN的残留量来计算ZHD活力单位，ZEN的残留量测定分为高效液相色谱紫外检测法和高效液相色谱荧光检测法。 试样酶液的制备 7.2.1 固态样品 固态试样应粉碎或充分碾碎，过0.25 mm孔径筛。称取适量试样两份，精确至0.1 mg，分别置于200 mL锥形瓶中，加入100 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（见5.11）。摇床或磁力搅拌提取30 min，离心机 4000 r/min离心5 min，取上清液再用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（见5.11）做二次稀释，使稀释后的待测酶液中ZHD活力单位控制在10 U/mL80 U/mL之间。 7.2.2 液态样品 移取适量样品，用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（见5.11）进行稀释、定容，稀释后的待测酶液中ZHD活力单位控制在10 U/mL80 U/mL之间。 如果稀释后酶液的pH偏离5.5， 应用磷酸氢二钠溶液 （见5.9）或柠檬酸溶液（见5.10）调整校正至pH 5.5，再用磷酸氢二钠-柠檬酸溶液（见5.11）适当稀释并定容。 高效液相色谱紫外检测法 7.3.1 紫外检测器检测条件 色谱柱：C18柱，长150 mm，内径4.6 mm，粒度5 m，或相当者； 流动相：乙腈/水（60/40，v/v）； 流速：1.0 mL/min； 检测波长：254 nm； 柱温：30 ； 进样量：20 L。 DB42/T 16302021 3 在上述色谱条件下，10 g/mL ZEN标准品色谱图参见图1。 图1 ZEN 标准品的高效液相色谱紫外检测法色谱图 7.3.2 标准曲线的绘制 取5支1.5 mL的塑料小管，用色谱纯甲醇将ZEN标准溶液逐级稀释得到浓度为2 g/mL、4 g/mL、6 g/mL、8 g/mL、10 g/mL的ZEN溶液，0.22 m膜过滤。 分别取上述系列浓度的ZEN标准溶液， 由低到高浓度进样检测。 以ZEN峰面积为X轴， ZEN浓度为Y轴，绘制标准曲线，获得线性回归方程，R2达到0.99。 7.3.3 测定 7.3.3.1 在 1.5 mL 的一次性小管中加入 480 L 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（见 5.11），再加入 10 L的底物 ZEN（1 mg/mL，用色谱纯甲醇配制），体系中有 10 g ZEN，在 37 孵育 10 min。 7.3.3.2 移取 1 mL 待测酶液，置于具塞试管内，在 37 孵育 5 min。 7.3.3.3 实验组：取 10 L 经过 37 孵育的待测酶液，加入小管（见 7.3.3.1）中，混匀；对照组：取 10 L 经过 37 孵育的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（见 5.11），加入小管（见 7.3.3.1）中，混匀。在 37 反应 10 min 后，加入 500 L 色谱纯甲醇终止反应，最后得到 1 mL 的体系。 7.3.3.4 体系中残留的 ZEN 应按照 7.3.1 中规定的检测条件进行检测，上样量 20 L，高效液相色谱测得峰见附录 A， 峰面积实验组为 S， 对照组为 S0， 做三次平行。 通过线性回归方程计算 ZHD 活力单位。 高效液相色谱荧光检测法 7.4.1 荧光检测器检测条件 色谱柱：C18柱，长150 mm，内径4.6 mm，粒度5 m，或相当者； 流动相：乙腈/水/甲醇（46/46/8，v/v/v）； 流速：1.0 mL/min； 检测波长：激发波长274 nm，发射波长440 nm； 柱温：30 ； 进样量：20 L。 在上述色谱条件下，1 g/mL ZEN标准品色谱图参见图2。 DB42/T 16302021 4 图2 ZEN 标准品的高效液相色谱荧光检测法色谱图 7.4.2 标准曲线的绘制 取6支1.5 mL的塑料小管， 用色谱纯甲醇将ZEN标准溶液逐级稀释得到浓度为0.2 g/mL、 0.5 g/mL、1 g/mL、2 g/mL、4 g/mL、8 g/mL的ZEN溶液，0.22 m膜过滤。 分别取上述系列浓度的ZEN标准溶液， 由低到高浓度进样检测。 以ZEN峰面积为X轴， ZEN浓度为Y轴，绘制标准曲线，获得线性回归方程，R2达到0.99。 7.4.3 测定 7.4.3.1 在 1.5 mL 的一次性小管中加入 480 L 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（见 5.11），再加入 10 L的底物 ZEN（1 mg/mL，用色谱纯甲醇配制），体系中有 10 g ZEN，在 37 孵育 10 min。 7.4.3.2 移取 1 mL 待测酶液，置于具塞试管内，在 37 孵育 5 min。 7.4.3.3 实验组：取 10 L 经过 37 孵育的待测酶液，加入小管（见 7.4.3.1）中，混匀；对照组：取 10 L 经过 37 孵育的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（见 5.11），加入小管（见 7.4.3.1）中，混匀。在 37 反应 10 min 后，加入 500 L 色谱纯甲醇终止反应，最后得到 1 mL 的体系。 7.4.3.4 体系中残留的 ZEN 应按照 7.4.1 中规定的检测条件进行检测，上样量 20 L，高效液相色谱测得峰面积实验组为 S，对照组为 S0，做三次平行。通过线性回归方程计算 ZHD 活力单位。 8 试验数据处理 试样中ZHD活力单位以XD表示，单位为酶活力单位每毫升（U/mL），按式（1）计算： =k(0S)1100.01 (1) 式中： XD试样稀释液中ZHD活力单位，单位为酶活力单位每毫升（U/mL）； k 标准曲线斜率； S0 对照组峰面积； S 实验组峰面积； 1 最后反应体系体积1 mL； 10酶解反应时间（min）； 0.01反应体系中所用的酶体积（mL）。 DB42/T 16302021 5 XD值应控制在10 U/mL-80 U/mL之间。如果不在这个范围，应重新选择酶液的稀释度，再进行分析测定。 试样ZHD活力单位以X表示，单位为酶活力单位每克（U/g）或者酶活力单位每毫升（U/mL），按式（2）计算： = (2) 式中： X 试样中ZHD活力单位，单位为酶活力单位每毫升（U/mL）； XD 试样稀释液中ZHD活力单位，单位为酶活力单位每毫升（U/mL）； n 试样的总稀释倍数。 酶活力的计算值保留三位有效数字。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 DB42/T 16302021 6 A A 附录A （资料性） ZHD 降解 ZEN 酶活测定 图A.1为玉米赤霉烯酮降解酶ZHD降解ZEN的高效液相色谱紫外检测图。其中：A为ZEN标准品；B、C为ZHD降解ZEN 10 min、 30 min的高效液相色谱检测图； D为无酶对照处理ZEN 2 h的高效液相色谱检测图。 图A.1 玉米赤霉烯酮降解酶 ZHD 降解 ZEN 的高效液相色谱紫外检测图