DB42∕T 1631-2021 禽蛋中酰胺醇类药物残留量的测定 高效液相色谱—串联质谱法(湖北省).pdf

ICS 67.120.20 CCS B 45 DB42 湖北省地方标准 DB42/T 16312021 禽蛋中酰胺醇类药物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法 Determination of amphenicols residues in eggs by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2020-12-30 发布 2021-03-01 实施 湖北省市场监督管理局 发 布 DB42/T 16312021 I 目 次 前言 . 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 1 5 试剂和材料 . 1 6 仪器和设备 . 2 7 试样的制备和保存 . 2 8 测定步骤 . 2 9 结果计算 . 4 10 灵敏度、准确度和精密度 . 6 附录 A （资料性） . 7 DB42/T 16312021 III 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由湖北省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位: 湖北省兽药监察所、 武汉华扬动物药业有限责任公司、 湖北省农科院畜牧兽医研究所、湖北新佳农牧科技有限公司。 本文件主要起草人：曾勇、王峻、王建华、董文婷、马立保、张金林、罗青平、舒金秀、卢芳、陈肖、金秀娥、徐军、周青、吴晓翠、龚波、冯超林。 本文件实施过程中有疑问，可咨询湖北省农业农村厅，联系电话：[phone]，邮箱：；湖北省兽药监察所，联系电话：[phone]，邮箱：。对本文件有关修改意见建议请反馈至湖北省兽药监察所， 联系电话： [phone]， 邮箱： 。 DB42/T 16312021 1 禽蛋中酰胺醇类药物残留量的测定 高效液相色谱-串联质谱法 1 范围 本文件规定了禽蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺残留量的液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋和鹌鹑蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及其代谢物氟苯尼考胺残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中残留的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺，用乙腈提取，正己烷除脂，PCX 固相萃取小柱净化，液相色谱-串联质谱测定，氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考以基质匹配内标法定量，氟苯尼考胺以基质匹配外标法定量。 5 试剂和材料 5.1 以下所用试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水为符合 GB/T 6682 规定的一级水。 5.2 乙腈：色谱纯。 5.3 甲醇：色谱纯。 5.4 正己烷：优级纯。 5.5 氨水：优级纯。 5.6 10%甲醇溶液：取 10 mL 甲醇（5.3） ，用水溶解并稀释至 100 mL。 5.7 5%氨水甲醇溶液：取 5 mL 氨水（5.5），用甲醇溶解并稀释至 100 mL。 5.8 标准物质：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考，含量99.0%；氟苯尼考胺，含量98.0%。 5.9 内标标准液：氘代氯霉素（d5-氯霉素），100 g/mL，溶剂为丙酮，氘化度98%。 5.10 标准储备液：精密称取 10 mg 的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺标准物质于 100 mL容量瓶中，用甲醇分别配成 100 g/mL 的标准储备液，-18 以下保存，有效期 6 个月。 DB42/T 16312021 2 5.11 混合标准中间液：准确量取 1.00 mL 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的标准储备液（5.10）于 100 mL 容量瓶中，用甲醇配成浓度为 1 g/mL 的混合标准中间液，于 4 以下保存，有效期1 个月。 5.12 混合标准工作液：准确量取 1.00 mL 浓度为 1 g/mL 的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的混合标准中间液（5.11）于 100 mL 容量瓶中，用甲醇配成浓度为 10 ng/mL 的混合标准工作液，现用现配。 5.13 内标标准中间液： 准确吸取100 L内标标准液 （5.9） 于10 ml容量瓶中， 用甲醇配成浓度为1 g/mL的内标标准中间液，于 4 以下保存，有效期 1 个月。 5.14 内标标准工作液：准确吸取 1.00 mL 内标标准中间液（5.13）于 100 ml 容量瓶中，用甲醇配成浓度为 10 ng/mL 的内标标准工作液，现用现配。 5.15 空白基质提取液： 选取不含待测物的样品， 不加入内标标准工作液， 其他按 8.1 和 8.2 步骤操作，得到空白基质提取液。 5.16 基质标准工作溶液的配制：根据标准的灵敏度和仪器线性范围，精密量取一定量的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氟苯尼考胺的混合标准工作液和内标标准工作液适量，用空白基质提取液配成浓度为0.25 ng/mL、 0.5 ng/mL、 1 ng/mL、 2 ng/mL、 5 ng/mL、 10 ng/mL 和 20 ng/mL 的系列基质标准工作溶液 （氯霉素同位素内标浓度为 2 ng/mL），现用现配。 5.17 固相萃取小柱：PCX（60 mg，3 mL）。 6 仪器和设备 6.1 液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。 6.2 天平：感量 0.01 g 和 0.01 mg。 6.3 氮吹仪。 6.4 冷冻高速离心机：转速10000 r/min。 6.5 固相萃取装置。 6.6 振荡器。 6.7 涡旋混合器。 6.8 离心管：50 mL。 7 试样的制备和保存 7.1 试样的制备 禽蛋样品的蛋清蛋黄均匀混匀后作为供试试样。 7.2 试样的保存 -18 以下条件保存。 8 测定步骤 8.1 提取 称取5 g（精确至0.01 g）试样，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入内标标准工作液（5.14）100 L，加入10 mL乙腈（5.2），于涡旋混合器上涡旋1 min，振荡5 min，10000 r/min离心10 min，取上清液转DB42/T 16312021 3 移至另一离心管中。上清液加乙腈饱和的正己烷10 mL，涡旋混匀，10000 r/min离心5 min，弃去上层正己烷， 下层再加乙腈饱和的正己烷10 mL重复操作一次， 取下层乙腈在40 水浴中氮吹至近干， 加入2 mL水溶解备用。 8.2 净化 取PCX固相萃取小柱，依次用甲醇3 mL，水3 mL活化，将备用液（8.1）以每秒一滴的速度全部过柱，用水淋洗， 真空抽干， 再用3 mL5%氨水甲醇洗脱， 收集洗脱液， 洗脱液在40 水浴中氮吹至近干。 用1 mL水溶解，涡旋1 min，过0.22 m滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。 8.3 测定 8.3.1 液相色谱条件 色谱柱：C18柱，粒径5 m，内径2.1 mm，柱长150 mm，或相当者； 流动相：梯度洗脱条件见表1； 柱温：40 ； 流速：0.3 mL/min； 进样量：10 L。 表 1 梯度洗脱程序 时间（min） 10%甲醇（%） 乙腈（%） 1 80 20 3 30 70 5 80 20 6 80 20 8.3.2 质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源(ESI)； 扫描方式: 负离子扫描（氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考）和正离子扫描（氟苯尼考胺）； 离子源接口电压：4.5 kv； 加热模块温度：400 ； DL(脱溶剂管)温度：250 ； 雾化气：氮气3.0 L/min； 干燥气：氮气10 L/min； 碰撞气：氩气； 驻留时间：100 ms； 延迟时间：3 ms； 多反应监测（MRM采集模式）； 各种药物的MRM参数见表2。 DB42/T 16312021 4 表 2 MRM 参数 药物名称 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z Q1 Pre Bias(V) CE （V） Q3 Pre Bias（V） 氯霉素 321.20152.15 321.20152.15 16.0 18.0 28.0 321.20194.20 16.0 13.0 20.0 甲砜霉素 354.00185.10 354.00185.10 18.0 21.0 19.0 354.00290.00 18.0 13.0 20.0 氟苯尼考 356.00185.20 356.00336.00 18.0 20.0 19.0 356.00336.00 18.0 11.0 23.0 氯霉素-D5 326.10157.15 326.10157.15 16.0 18.0 16.0 氟苯尼考胺 248.10130.00 248.10230.10 -12.0 -21.0 -23.0 248.10230.10 -13.0 -12.0 -26.0 8.4 定性定量方法 8.4.1 定性方法 每种被测组分选择1个母离子，2个以上子离子，在相同试验条件下，样品中待检测物质和内标物的保留时间之比，也就是相对保留时间，与标准溶液中对应的相对保留时间偏差在2.5%之内；且样品谱图中各组分的两个子离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液的相对丰度一致，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物。 表 3 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度（%） 50 2050 1020 10 允许的相对偏差（%） 20 25 30 50 8.4.2 定量方法 8.4.2.1 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考测定以内标法定量：在仪器最佳工作条件下，对基质标准工作溶液进样，以标准溶液中被测组分峰面积和氘代氯霉素（d5-氯霉素）峰面积的比值为纵坐标，标准溶液中被测组分浓度与氘代氯霉素（d5-氯霉素）浓度的比值为横坐标绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值应在仪器测定的线性范围内。 8.4.2.2 氟苯尼考胺测定以外标法定量：在仪器最佳工作条件下，对基质标准工作溶液进样，以标准溶液中被测组分峰面积为纵坐标， 标准溶液中被测组分浓度为横坐标绘制标准工作曲线， 用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中待测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。 氯霉素、氘代氯霉素（d5-氯霉素）、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的基质匹配标准溶液和空白添加试样溶液中特征离子的质量色谱图参见附录A。 8.5 空白试验 除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。 9 结果计算 9.1 氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定结果按式（1）式（4）计算。 单点校准： DB42/T 16312021 5 (1) 或基质标准曲线校准，由： (2) 求得a和b，则 (3) (4) 式中： X试样中被测组分的残留量，单位为微克每千克（g/kg）； 对照溶液中被测组分的浓度，单位为微克每升（ g/L）； Ci基质标准曲线中被测组分的浓度，单位为微克每升（ g/L） ； V试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）； 试样称取量，单位为克（g）； 对照溶液中被测组分的峰面积； 试样中内标物的浓度，单位为微克每升（ g/L）； 对照溶液中内标物的浓度，单位为微克每升（ g/L）； 试样溶液中被测组分的峰面积； 试样溶液中内标物的峰面积； 对照溶液中内标物的峰面积。 9.2 氟苯尼考胺残留量的测定结果按式（5）式（8）计算。 单点校准： (5) 或基质标准曲线校准，由： (6) 求得a和b，则 DB42/T 16312021 6 (7) (8) 式中： X试样中被测组分的残留量（g/kg）； 对照溶液中被测组分的浓度，单位为微克每升（ g/L）； C基质标准曲线中被测组分的浓度，单位为微克每升（ g/L）； 试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）； 试样称取量，单位为克（g）； 试样溶液中被测组分的峰面积； 对照溶液中被测组分的峰面积。 计算结果需扣除空白值，测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。 10 灵敏度、准确度和精密度 10.1 灵敏度 本方法的检测限为0.1 g/kg，定量限为0.2 g/kg。 10.2 准确度和精密度 本方法在0.2 g/kg2 g/kg添加浓度水平上的回收率为60%120%。 本方法批内相对标准偏差20%，批间相对标准偏差20%。 DB42/T 16312021 7 A A 附 录 A （资料性） 酰胺醇类药物离子色谱图 图 A.1 给出了酰胺醇类药物基质匹配标准溶液离子色谱图， 图 A.2 给出了酰胺醇类药物空白鸡蛋添加的离子色谱图。 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5min0.000.250.500.751.001.251.501.752.00(x10,000)1:chlorumphenicol 321.20152.15(-) CE: 18.0 1）氯霉素特征离子质量色谱图（321.20152.15） 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5min0.000.250.500.751.001.251.501.752.00(x10,000)2:chlorumphenicol-d5 326.10157.15(-) CE: 18.0 2）氯霉素D5特征离子质量色谱图（326.10157.15） DB42/T 16312021 8 0.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.502.753.003.253.503.754.004.25min0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0(x10,000)3:JFMS TIC(-) 3）甲砜霉素特征离子质量色谱图（354.00185.10） 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0min0.000.250.500.751.001.251.501.752.00(x1,000)4:FBNK 356.00336.00(-) CE: 11.0 4）氟苯尼考特征离子质量色谱图（356.00336.00） DB42/T 16312021 9 0.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.502.753.003.253.503.754.004.25min0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0(x10,000)1:FBNKA 248.10230.10(+) CE: -12.0 5）氟苯尼考胺特征离子质量色谱图（248.10230.10） 图A.1 1.0 g/L氯霉素、氯霉素D5、甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺基质匹配标准溶液离子色谱图 DB42/T 16312021 10 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5min0.000.250.500.751.001.251.501.752.00(x10,000)1:chlorumphenicol 321.20152.15(-) CE: 18.0 1）氯霉素特征离子质量色谱图（321.20152.15） 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5min0.000.250.500.751.001.251.501.752.00(x10,000)2:chlorumphenicol-d5 326.10157.15(-) CE: 18.0 2）氯霉素D5特征离子质量色谱图（326.10157.15） DB42/T 16312021 11 0.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.502.753.003.253.503.754.004.25min0.00.10.20.30.40.50.60.70.80.91.0(x10,000)3:JFMS TIC(-) 3）甲砜霉素特征离子质量色谱图（354.00185.10） 0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.5min0.000.250.500.751.001.251.501.752.00(x10,000)4:FBNK 356.00336.00(-) CE: 11.0 4）氟苯尼考特征离子质量色谱图（356.00336.00） DB42/T 16312021 12 0.000.250.500.751.001.251.501.752.002.252.502.753.003.253.503.754.004.25min0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0(x10,000)1:FBNKA 248.10230.10(+) CE: -12.0 5）氟苯尼考胺特征离子质量色谱图（248.10230.10） 图A.2 0.2 g/kg空白鸡蛋添加氯霉素、氯霉素D5、甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺离子色谱图 _