DB21∕T 3388—2021 规模化奶牛场乳房炎防治技术规范(辽宁省).pdf

ICS 11.220 CCS B 41 21 辽宁省地方标准 DB21/T 33882021 规模化奶牛场乳房炎防治技术规范 Technical Specification For Prevention And Treatment Of Dairy Cattle Mastitis In Large Scale Dairy Farms 2021 - 02 - 28 发布 2021 - 03 - 28 实施 辽宁省市场监督管理局 发 布 DB21/T 33882021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件由辽宁省农业农村厅提出。 本文件由辽宁省农业农村厅归口。 本文件起草单位：辽宁省农业发展服务中心、辽宁辉山乳业有限公司。 本文件主要起草人：魏园园、张皓淳、张大为、杨洺扬、高志峰、金 晖、王宏燕、王 冰、邓文超、里 里、王连山、李巍 本文件发布实施后， 任何单位和个人如有问题和意见建议， 均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址： 辽宁省农业农村厅 （沈阳市和平区太原北街2号） ， 联系电话： [phone]； 标准起草单位通讯地址： 辽宁省农业发展服务中心 （沈阳市沈河区万柳塘路105号甲） ， 联系电话：[phone]。 DB21/T 33882021 1 规模化奶牛场乳房炎防治技术规范 1 范围 本文件规定了奶牛乳房炎的术语和定义、诊断检测、预防、治疗及消毒方法。 本文件适用于辽宁省行政区域内规模化奶牛场对奶牛乳房炎的防治。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 13078 饲料卫生标准 NY/T 388 畜禽场环境质量标准 NY/T 2962 奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定方法 NY 5027 无公害食品 畜禽饮用水水质 NY/T 5030 无公害食品 畜禽饲养兽药使用准则 NY 5032 无公害食品 畜禽饲料和饲料添加剂使用准则 NY 5047 无公害食品 奶牛饲养兽医防疫准则 NY/T 5049 无公害食品 奶牛饲养管理准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 规模化奶牛场 intensive cow farm 规模化奶牛场是指经当地农业、工商等行政主管部门批准，具有法人资格，同时奶牛存栏量头100以上的奶牛场。 3.2 奶牛乳房炎 bovine mastitis 又称乳腺炎，指乳腺组织的各类炎症，主要由病原微生物引起，按临床表现分为隐性乳房炎和临床型乳房炎两种类型。 3.3 临床型乳房炎 Clinical mastitis 在奶牛的乳房， 乳汁， 肉眼可见炎症病理变化， 乳汁排出不通畅或者困难， 泌乳减少或停止， 乳汁变性，乳汁稀薄或变稠。或患部乳房组织出现不同程度的充血、肿胀、温热和疼痛，乳房上淋巴结肿大。 3.4 亚临床型乳房炎（隐性乳房炎）Subclinical mastitis DB21/T 33882021 2 奶牛乳房炎的最常见形式，又称亚临床型乳房炎。临床检查无症状，乳房和乳汁均无肉眼可见的病理变化等，但如果采用体细胞计数方法，其乳汁中的体细胞数量3105次个/mL。 4 预防 4.1 营养 按照 GB 13078、NY 5032 和 NY/T 5049 执行，根据奶牛各生长、生产阶段的生理状况，制定合理的日粮结构，供给奶牛优质饲料，禁止饲喂发霉变质饲料和冰冻饲料。 4.2 卫生管理 选择高效、低毒、腐蚀性低的消毒剂，制定科学合理的消毒程序，定期对牛舍、运动场和用具彻底清洗和消毒，消毒操作按照 NY/T 5049 的规定执行。 4.2.1 人员 进入生产区人员需要更换消毒后的工作服和鞋帽。 4.2.2 牛床 每日及时清扫牛床内的粪便，并冲洗干净，每周消毒一次。 4.2.3 牛舍通道 每次搬运饲料后及时清扫牛舍内通道，每周消毒一次。 4.2.4 运动场 每日定时清扫运动场粪便并清洗，每周消毒一次。 4.2.5 用具 牛场用具每周消毒一次。 4.3 榨乳 4.3.1 乳房清洗和消毒 榨乳前先用 4050的温水将乳房擦拭干净，并选用有效消毒药液，浸泡消毒奶头 20s，用清洗消毒过的干毛巾擦拭干净奶头，做到一牛一巾，擦拭干净牛体和乳房后及时挤奶。 4.3.2 手工榨乳 乳房清洗消毒后，用清洗消毒过的干毛巾抹干净乳头，采用拳握法进行榨乳，榨乳速度为 84 次/min 120 次/min，榨乳量以 1 kg/min2 kg/min，弃去前 3 把奶，榨乳期间不停顿，挤完奶后用药浴液再次浸泡乳头，进行消毒处理。 DB21/T 33882021 3 4.3.3 机械榨乳 参照 4.3.1 清洗和消毒乳房后 45s 内套好奶杯,榨乳完成后关闭集乳器的真空 2s3s 后移去奶杯，随后用手工方法挤净乳房内余奶，再用消毒药液浸泡乳头。 4.4 榨乳机的消毒 4.4.1 榨乳前 用 80至 90的热水对榨乳机管道消毒 5 分钟。 4.4.2 榨乳后 酸碱洗液交替循环清洗 10 min15 min，用适当浓度的消毒液循环清洗 5 分钟。 4.5 乳房护理 进行乳头药浴， 自然干燥后， 再用浸过 75%酒精棉球擦拭乳头， 对乳区注射抗生素 （或维生素油剂） 。 4.6 品种选择 引进奶牛时，要查其系谱，选择抗乳房炎病能力强的奶牛，布病和结核病检测均为阴性，不用乳房炎遗传系数高的公牛精液。 5 诊断 5.1 临床诊断 乳房炎按临床表现可分为临床型和亚临床型（通常称为隐性乳房炎），临床型又可分为急性型、亚急性型和慢性型。 5.1.1 急性乳房炎 突然发病，乳房红肿、变硬、疼痛，乳汁异常，出现全身症状。病牛体温升高，食欲减退，反刍减少，脉搏增速，脱水，全身衰弱、沉郁。当病情发展很快且症状严重时可危及生命。 5.1.2 亚急性乳房炎 病牛一般没有全身症状，乳汁中有絮片、凝块，并呈水样。乳房有轻微发热、肿胀和疼痛。 5.1.3 慢性乳房炎 慢性乳房炎多由持续感染引起，或由于急性乳房炎转至。长期存在最终可导致乳腺组织纤维化，乳房萎缩，出现硬结。慢性乳房炎易成为牛群中的感染源，治疗价值不大，应及早淘汰。 5.1.4 隐性乳房炎 乳房和乳汁肉眼观察无异常，经检测，乳汁体细胞数增加。隐性乳房炎病牛可携带病原，可以感染其它健康牛。 5.2 实验室诊断 DB21/T 33882021 4 5.2.1 临床型乳房炎 临床型乳房炎主要根据临床症状进行诊断。病原微生物实验室诊断见附录 A、B。 5.2.2 隐性乳房炎 检测方法包括乳汁体细胞计数法（CMT 和体细胞直接计数法）、乳汁 pH 检验法、电导率值检验法、酶类检测法和乳成分直接检测法。本文件主要介绍体细胞计数法。检测方法参见附录 A、B。 6 处置 6.1 临床型乳房炎处置 6.1.1 隔离 对病牛实施隔离，接触过的用具及环境进行彻底消毒。 6.1.2 治疗 按照对症治疗、局部治疗、抗感染和辅助性治疗相结合的原则对确诊的病牛进行有效治疗措施，防止病原扩散。 6.1.2.1 抗感染治疗 选用抗感染药物治疗。治疗前应进行乳汁采样，进行病原培养，根据药敏实验结果选择用药 6.1.2.2 对症治疗 解热、镇痛、抗过敏。 6.1.2.3 辅助性治疗 采用乳房基部封闭、乳房按摩、增加挤乳次数、乳房冷敷、外敷药物等缓解乳房的肿胀。 6.1.3 牛奶处理 病牛奶用专用容器集中销毁，严格执行休药期和弃奶规定。 6.2 隐性乳房炎处置 6.2.1 奶牛的处置 对确诊为隐性乳房炎的病牛应隔离观察。对连续检测 CMT 呈阳性、乳汁表现异常、产奶量低、反复发作的病牛，进行淘汰。干乳前 10 天进行隐性乳房炎监测， 对阳性反应在“”以上的牛及时治疗，干乳前 3 天再监测 1 次，阴性反应方可停乳。 6.2.2 牛奶的处置 应严格执行休药期和弃奶规定。 DB21/T 33882021 5 6.3 消毒 选用适宜的药物药浴乳头； 对病牛污染的场所、 用具、 物品， 特别是榨乳设备进行清洗和严格消毒，消毒方法见附件 5。 7 预防措施 7.1 创造良好的卫生环境 牛舍、运动场设计合理，空间宽敞，保持阳光充足；牛床保持清洁、干燥，垫草应干、软、清洁、新鲜，经常更换。定期对牛舍和运动场进行消毒，乳房炎高发季节应加强消毒。 7.2 加强饲养管理 根据奶牛的营养需要，各生产阶段精、粗饲料搭配合理，增加青绿、青贮料的饲喂量，以乳定料，维持机体最佳生理机能。停乳后要随时检查乳房，发现异常应立即处理；在干奶后期应适当增加精料，适当控制盐和多汁饲料的喂量，在饲养管理过程中避免应激。适当增加奶牛的运动，增强机体抗病力。 干奶期，每头奶牛每天供应 1.0g 维生素 E，每公斤日粮不超过 0.3mg 的硒。 7.3 规范榨乳操作 榨乳操作采用“两次药浴，纸巾干擦”。 7.3.1 榨乳前检查 先检查乳房外表是否有红、肿、热、痛症状或创伤。 7.3.2 乳头预药浴 选用专用的乳头药浴液，进行前药浴，药液作用时间应保持在 20s 30s 。（注：乳房污染严重时，用含消毒剂的温水清洗干净再进行药浴） 7.3.3 擦干乳头 药浴后用一次性纸巾擦干乳头和基部。 7.3.4 验奶 将头 3 把奶挤到专用容器中，检查牛奶是否有凝块、絮状物或呈水样，牛奶正常可榨乳；异常的，应及时治疗，单独榨乳。严禁将异常奶混入正常牛奶中。 7.3.5 上机榨乳 套上榨乳杯组（套杯过程中尽量避免空气进入杯组中，全过程在 90s 内完成）。榨乳过程中观察真空稳定情况和榨乳杯组奶流情况，适当调整榨乳杯组的位置。榨乳接近结束，先关闭真空阀，再移走榨乳杯组。严禁下压榨乳机，避免过度榨乳。 DB21/T 33882021 6 7.3.6 榨乳后药浴 榨乳结束后，迅速进行乳头药浴 3s5s。 7.4 定期检查 加强对乳房炎的监控，每月进行二次检查。 7.5 干奶期预防 进行隐性乳房炎检测，阴性奶牛方可进行干奶。榨乳后，向每个乳区注入适量的干奶药。 DB21/T 33882021 7 A A 附录A （资料性） 奶牛乳房炎病原菌分离鉴定方法 A1.金黄色葡萄球菌的检验 A1.1 主要试剂和试验方法： A1.1.1 革兰氏染色： A1.1.1.1 涂片、火焰固定。 A1.1.1.2 草酸铵结晶紫染1min。 草酸铵结晶紫染液的配制： 溶液A：结晶紫2g，95%酒精20mL，溶液B：草酸铵0.8g，蒸馏水80mL。将A、B溶液混合，用滤纸过滤后即可使用。 A1.1.1.3 自来水冲洗。 A1.1.1.4 加碘液覆盖涂面染约1min。 A1.1.1.5 水洗，用吸水纸吸去水分。 A1.1.1.6 加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20s后水洗，吸去水分。 A1.1.1.7 沙黄液（稀）染2min后，自来水冲洗。干燥，镜检。 革兰氏阳性菌染色为蓝紫色，革兰氏阴性菌染色为红色。 A1.1.2 触酶试验 取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加 3%过氧化氢数滴；或直接滴加 3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。有大量气泡产生者为阳性，无则为阴性。 A1.1.3 血浆凝固酶试验 吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌浸液肉汤24h培养物充分混匀， 置361培养， 每隔半小时观察一次，连续观察6h，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。 DB21/T 33882021 8 A1.2 乳样的采集 选取出现临床症状 （或者怀疑为隐性乳房炎） 乳房炎奶牛， 先用温水， 再用0.2%新洁尔灭擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳头。采样者同时进行手指擦拭消毒。每个乳室先挤去头23把奶，以排除污染的杂菌，每头奶牛取乳样5mL于无菌乳样杯中，待检。 A1.3 病原菌的分离培养 初步诊断： 将少量乳汁涂片、 革兰氏染色、 镜检。 如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为葡萄球菌。 分离培养：将乳样摇匀，分别取适量接种于营养肉汤（10%血清）、鲜血琼脂、麦康凯琼脂培养基（平板）后，置于37温箱培养2448h。观察每个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长表现。 普通琼脂平板上，37，2472h培养后，可见到湿润、光滑、隆起的圆形金黄色菌落。挑取典型菌落涂片、染色、镜检（镜检呈葡萄状排列，无芽孢、荚膜，直径0.51m，革兰氏染色阳性），并挑取单个可疑菌落移植于肉汤和斜面培养基，经37培养2448h。24h后没有长菌的平板，再用相应的增菌肉汤涂划一次， 继续培养， 2448h后， 再作检查， 以防漏检。 将剩余的乳样存放于4冰箱内备用。 营养肉汤中呈浑浊生长，管底有少量灰白色沉淀； 血液琼脂平板中菌落较大，呈金黄色、圆形，周围出现明显的溶血。 A1.4 生化鉴定 触酶试验：触酶阳性。 血浆凝固酶试验：凝固酶试验阳性。 糖发酵试验：能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖。 色素产生情况：能产生金黄色色素。 A1.5 毒力试验 将上述经过生化试验鉴定的细菌悬液用灭菌生理盐水作适当稀释， 对随机分组的小鼠进行腹腔注射接种，接种量为0.5mL/只（家兔皮下接种1.0mL或者静脉接种0.10.5mL），能够致死动物或者内脏出现脓肿可以确定有毒力。 A1.6 病原菌的重分离试验 DB21/T 33882021 9 对接种后发病、死亡小鼠（家兔）的肝脏进行病原菌重分离。进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株是否为原接种菌。如果是则进一步确定病原菌为金黄色葡萄球菌。 A2.链球菌的检验 引起临床型乳房炎或者隐性乳房炎的链球菌常见的有无乳链球菌、停乳链球菌以及乳房链球菌。 A2.1 主要试剂和试验方法 CAMP试验：在血琼脂平板上用金黄色葡萄球菌培养物划一条直线，然后将链球菌培养物划一条线，与金黄色葡萄球菌培养物的划线相互垂直， 但不要接触， 二者相距35mm， 各链球菌分离菌划线间距1020mm。置37温箱内培养24h后观察结果。在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。 A2.2 乳样的采集 选取出现临床症状 （或者怀疑为隐性乳房炎） 乳房炎奶牛， 先用温水， 再用0.2%新洁尔灭擦洗乳房，最后用70%的酒精擦拭乳头。采样者同时进行手指擦拭消毒。每个乳室先挤去头23把奶，以排除污染的杂菌，每头奶牛取乳样5mL于无菌乳样杯中，待检。 A2.3 病原菌的分离培养 初步诊断：将少量乳汁涂片、革兰氏染色、镜检。如发现圆球形革兰氏阳性细菌可怀疑为链球菌。 分离培养：将乳样摇匀，分别取适量接种于营养肉汤（10%血清）、鲜血琼脂、麦康凯琼脂培养基（平板）后，置于37温箱培养2448h。观察每个平板中细菌生长的情况，记录菌落生长表现。 普通琼脂平板上，37，2472h培养后，未见到菌落。 鲜血琼脂平板上长有灰白色、半透明表面光滑圆形隆起的小菌落，出现溶血现象，如果是溶血则疑为无乳链球菌，如果为溶血，疑为停乳链球菌或者乳房链球菌，如为溶血，则疑为乳房链球菌。 血清肉汤中生长初呈均匀浑浊，管底出现絮状沉淀，上清变得透明。 挑取典型菌落涂片、染色、镜检，镜检如呈球状，短链状或者长链状排列，无芽孢、荚膜，革兰氏染色阳性则疑为链球菌。 A2.4 生化鉴定 DB21/T 33882021 10 镜检形态符合链球菌特性，且触酶试验阴性细菌，即鉴定为链球菌属细菌。若细菌CAMP试验阳性，不水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为无乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，不水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为停乳链球菌；若细菌CAMP试验阴性，水解七叶苷和马尿酸钠，即鉴定为乳房链球菌。 A2.5 动物试验 对实验动物，只有停乳链球菌具有致病性，将其18h血清肉汤培养物0.5mL注入小白鼠腹腔，或给家兔静脉接种12mL，可使动物在1周内死亡。对接种后发病、死亡小鼠（家兔）的肝脏进行病原菌重分离。进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株是否为原接种菌。如果是则进一步确定病原菌为停乳链球菌。其他两种链球菌并不能使试验动物致死。 DB21/T 33882021 11 B B 附录B （资料性） 奶牛乳房炎治疗诊断方法 B1.乳汁体细胞计数法 推荐使用体细胞计数仪进行乳汁体细胞计数。 体细胞计数法有直接计数法和间接计数法。 直接计数法中简便易行的方法是直接用显微镜进行体细胞计数（SCC），间接计数法就是后面提到的CMT法。 B1.1 主要试剂和材料 美蓝染色液：美蓝乙醇饱和溶液30mL（美蓝2g，95%乙醇100mL），10%氢氧化钠溶液0.1mL，蒸馏水100mL，将上列溶液混合摇匀，过滤后备用。二甲苯、95%乙醇。生物显微镜、载玻片、10L微量加样器（或移液枪）等。 B1.2 操作方法 B1.2.1 涂片制备 涂布：充分摇匀新鲜乳样，用10L微量加样器吸取中部乳汁10L，或用接种环蘸取等量的乳汁，将乳样滴于玻片一端中侧，仔细涂布成约1cm2面积的乳膜（为便于操作，可在玻片下垫衬一张硬纸板，纸板上用毛笔划数个面积为1cm2的方格透视）。 干燥、脱脂、固定：涂好乳膜的玻片于37温箱中干燥，然后用二甲苯脱脂5min，再置95%乙醇中固定510min。 染色：玻片干燥后，用美蓝染色液染色5min。水洗，再用95%乙醇脱色数分钟，水洗干燥后镜检。 镜检及计数：在生物显微镜油镜下观察（最好用10目镜，其视野直径要求为0.016），计数100个视野内的细胞数，然后用下式计算：SCC100N/r2， 视野面积r23.1416(0.016/2)20.0002cm2 显微镜系数N1/0.0002100500，000 SCC系数每个视野的细胞平均数（即细胞总数100）细胞数/mL乳。 DB21/T 33882021 12 B1.3 判定标准 随着国际和国内乳品行业的接轨， 国内标准也在提高， 一般以每毫升牛奶中含20万个细胞为亚临床乳房炎的临界值（）；超过该值为阳性，低于该值则正常。 B2.加州乳房炎检测法（CMT） CMT是加州乳房炎试验的简称，即首先在美国加利福尼亚州使用的一种乳房炎检测试验。它是通过间接测定乳中体细胞数 （SCC） 来诊断隐性乳房炎的方法。 其原理是在表面活性物质和碱性药物作用下，乳中体细胞被破坏，释放出DNA，进一步作用，使乳汁产生沉淀或形成凝胶。体细胞数越多，产生的沉淀或凝胶也越多，从而间接诊断乳房炎和炎症的程度。该法是国际通用的隐性乳房炎诊断方法，其特点是简便、快速。我国研制出了类似的方法如BMT（北京奶牛研究所）、SMT（上海奶牛研究所、HMT（黑龙江省兽医科学研究所），以及LMT（中国农科院兰州兽医研究所）等。 B2.1 试剂和方法 CMT检测中用到的试剂和方法如下： 十二烷基磺酸钠30g溶解于1000mL蒸馏水， 用2M的氢氧化钠调节PH等于6.4，加入溴甲酚紫0.1g，即成CMT检验液，取乳房炎诊断盘1只，滴加被检乳2mL，诊断液2mL，缓缓作同心圆状摆。市售成品CMT诊断试剂或者其他方法的成品试剂，按照说明操作。 B2.2 判定标准：可以参考表 1。 表1 CMT法的判定方法及标准 反应判定反应判定 被检乳被检乳 反反 应应 状状 态态 体细胞数体细胞数 （千（千/ /毫升）毫升） 阴性 混合物呈液体状，倾斜检验盘时，流动流畅，无凝块 0200 可疑 混合物呈液体状，盘底有微量沉淀物，摇动时消失 200500 弱阳性 盘底出现少量黏性沉淀物，非全部形成凝胶状，摇动时，沉淀物散布于盘底，有一定的黏性 500800 阳性 全部呈凝胶状，有一定黏性，回转时向心集中，不易散开 8005000 强阳性 混合物大部分或全部形成明显的胶状沉淀物， 黏稠， 几乎完全黏附与盘底，旋转摇动时，沉淀集于中心，难以散开 5000 DB21/T 33882021 13