发光二极管630nm红光通过PI3K_AKT_mTOR通路抑制滑膜成纤维细胞炎症反应.pdf

年 月第 卷 第 期照明工程学报 .发光二极管 红光通过/通路抑制滑膜成纤维细胞炎症反应杜思琦 孟彩云 任丹丹 宋武琦 张凤民 刘海亮(哈尔滨医科大学伍连德研究所 哈尔滨医科大学微生物教研室 黑龙江省感染与免疫重点实验室 黑龙江 哈尔滨)摘 要:发光二极管()光照疗法是一种低能量光疗()在皮肤炎症治疗和术后疼痛缓解方面已被广泛研究 但其对类风湿性关节炎的作用及其机制尚不清楚 本研究采用 红光作为光源 以 刺激模拟炎症的类风湿关节炎患者组织中提取原代滑膜成纤维细胞(细胞)为模型 采用 和细胞划痕实验 检测不同剂量的 红光对炎症 细胞的活力 及其增殖和迁移的影响 采用 和 方法 检测、和 在细胞中 表达及细胞上清中蛋白表达的变化 采用免疫印迹法 检测细胞中、和 蛋白表达和磷酸化的变化 结果证实 红光可抑制 细胞的增殖和迁移 降低细胞中、和 炎症因子的 表达水平 光照剂量为 /的 红光降低了 细胞中、和 蛋白的表达和磷酸化水平 结果证实 红光可以通过下调/信号通路以及减少炎症因子的释放 抑制 细胞的炎症反应及其增殖和迁移关键词:发光二极管 红光 类风湿关节炎/信号通路 滑膜细胞 低能量光疗中图分类号:文献标识码:基金项目:国家重点研发计划资助项目()国家自然科学基金项目()黑龙江省自然科学基金优秀青年项目()通信作者:刘海亮:/():().()().照明工程学报 年 月 /./.:/:/引言类风湿性关节炎()是一种主要影响关节 尤其是滑膜关节的系统性自身免疫性疾病 主要表现为多个关节的慢性疼痛和肿胀 滑膜成纤维细胞作为 关节损伤的最终效应细胞 参与关节炎症和破坏 与晚期 的关节损伤密切相关 常用于体外探讨 的发病机制和筛选合适的临床药物 在目前许多治疗 的方法中 光疗已被用于治疗术后疼痛和炎症反应 既往研究利用类风湿关节炎滑膜成纤维细胞探索光疗机制 发现激光可抑制炎症因子的分泌 但这一结果的细胞分子机制尚不清楚 有待进一步研究光疗 中 的 光 生 物 调 节()是指通过激光或单色光的光辐射而非热效应对生物系统进行调节 它可以直接刺激或抑制生物功能 而不会造成不可逆的损害 与基于光照激发外源传递发色团的光动力疗法不同 因其无创性 而更常用于基础研究和临床治疗在 光疗中 低能量光疗法()较为常用 主要光源是激光和发光二极管()其中 作为随着半导体技术的迅速发展而出现的一种新型光源具有操作简便、安全可靠等优点 而得到更加广泛的应用 由于红光与红外线相比 前者的热效应不明显 能更好地保护组织细胞免受热损伤 而且与短波长的光相比 具有更深的穿透性 可以深入骨骼和关节促进早期骨损伤的伤口愈合 因此 本研究选用 红光照射 以验证和探讨光生物调节对类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞的影响及其可能的机制材料和方法 细胞培养与 诱导炎症细胞模型从 患者身上提取原代滑膜成纤维细胞作为实验对象 细胞在添加胎牛血清()和青霉素/链霉素溶液()的 中培养 培养的细胞在、环境中保存 终浓度为/的(公司)刺激滑膜细胞模拟炎症环境 发光二极管照射处理采用发光二极管 红光治疗仪(创盈光电医疗)进行细胞照射 细胞通过塑料培养板底部暴露在 红光照射下 每次照射所需时间分别为 、和 光照剂量分别为 /、/和/具体光源规格及参数见表 对于 刺激组在照射前需加入 /所有细胞均在生物安全柜内室温照射 对照组(非照射组)用铝箔包裹 细胞活力检测将 细胞(个/孔)接种到 孔板上 将细胞分成四组 分别暴露在、和/的 光照下 经照射处理后 采用 试剂(公司)检测细胞增殖 在每个孔中加入 (终浓度 /)孵育 使用吸光度 仪(公司)测量 处的吸光度 以确定细胞的活力 细胞划痕实验将 细胞(个/孔)接种到 孔板上 待细胞密度至 时 使用灭菌的 枪头垂直划一条直线 无菌 去除细胞碎片 加入不含血清的 红光照射时间分别为 和 在 、的培养箱中进行培养 每 用 (放大倍数 )拍摄划痕愈合图像 使用 软件计算相同条件下的迁移距离 实时定量聚合酶链式反应()使用总 提取试剂盒(新海基因公司)从滑膜细胞中进行各样本 提取 等量的总 第 卷第 期 杜思琦等:发光二极管 红光通过/通路抑制滑膜成纤维细胞炎症反应 ()通过逆转录试剂盒(公司)进行逆转录 利用人基因特异性引物和反义引物 根据 上公布的序列 扩增促炎细胞因子 见表 表 光生物调节参数 参数 规格波长峰值/峰值功率/平均功率/光斑直径/功率密度/(/)照射频率连续照射与照射物体距离/组别 照射时间/能量密度/(/)表 引物序列 基因引物序列()在 热循环仪(公司)上进行 用于定量 扩增的程序:、的预变性 步扩增包括、(个循环)蛋白印迹分析用 裂解缓冲液(碧云天公司)和 裂解细胞 蛋白测定试剂盒(美伦生物公司)测定裂解物中的蛋白浓度 裂解液与 样品缓冲液在 下孵育 凝胶电泳上样量为每组样本 采用 凝胶电泳系统(凝胶 公司)进行凝胶电泳并转移到 膜上 用含 脱脂乳的 和 ()在室温下封闭 然后用一抗(比例均为 )在 下孵育过夜 室温下用 结合的二抗(公司)孵育 采用化学发光(公司)和放射自成像()检测免疫反应蛋白 并使用 (美国)进行灰度扫描 蛋白印迹所用抗体信 息 如 下:(公司)、(公 司)、(公 司)、(公 司)、(公 司)、(公司)、(公司)、(公司)酶联免疫吸附实验检测炎症因子收集各组细胞上清样品 经 离心 后 用 酶 联 免 疫 吸 附 实 验()试 剂 盒(公司)测定 和 的水平 所有的操作都按照说明书规定进行 采分光光度度仪(公司)读取 处的光密度()值 使用标准曲线计算各组的细胞因子浓度 统计分析所有实验至少重复三次 实验数据均以 表示 用 检验和 检验进行正态分布和方差齐性检验 实验中两个实验组间差异的统计学意义采用非配对 检验 每个分析的显著性水平设为 使用 ()软件对数据进行统计分析结果 红光照射降低 细胞活力采用 法测定经不同光照剂量(、/)的 红光照射后 细胞的活力 如图 所示 细胞的活力呈剂量依赖的方式逐渐被抑制 此外 在显微镜下观察细胞时细胞形态无明显变化 照明工程学报 年 月图 红光抑制 细胞的活性()细胞在 和、和 /的光照处理后的显微镜图像()根据照射后线粒体还原酶活性的相对变化 细胞对三种可见光 红色辐射剂量(、和 /)的活力注:细胞在连续 天内每天处理 次 检测线粒体还原酶活性 统计学意义用非配对 检验 ()/.()(/).:.红光照射抑制 细胞迁移采用细胞划痕法检测 不同光照剂量对 细胞迁移的影响 图 结果显示 当光照剂量为/时 照射 能明显抑制划痕修复 并且 细胞形态无明显变化 当照射时间缩短至 、光照剂量为/时 显微镜下观察滑膜成纤维细胞形态也无变化 细胞迁移受到抑制 但差异无统计学意义图 照射后划痕实验的代表性图像 红光照射对 细胞炎症因子 表达及分泌水平的影响细胞接受不同光照剂量(、和 /)通过 检测细胞因子的相对表达水平 最后一次照射结束 后提取细胞 收集细胞上清进行 检测 如图 所示 炎症因子、表达明显降低 此外 炎症细胞因子的产生受到 照射时间的影响 当光照剂量为第 卷第 期 杜思琦等:发光二极管 红光通过/通路抑制滑膜成纤维细胞炎症反应 /时 诱导的滑膜成纤维细胞中 和 的产生显著降低 以上结果表明 细胞中炎症细胞因子的表达及分泌可以被 照射抑制图 在不同的光照剂量下 照射对 细胞中炎症细胞因子的影响 显示 细胞中 ()、()、()的相对表达水平的变化 酶联免疫吸附法显示在 的 光照射 /和 /后 ()、()和 ()的相对表达水平的变化注:.()()().()()()/.:.红光照射作用于 细胞的机制探究/信号通路在 细胞的增殖调控中起重要作用 为了确定 照射是否调节该信号通路 采用蛋白印迹检测不同光照剂量对 细胞中/信号通路蛋白表达的影响 在实验中 替换含有 /的培养基后立即进行第一次照射 具有代表性的 图像如图 所示 对多种蛋白的定量分析表明 当光照剂量为/时 照明工程学报 年 月图 照射在/途径中的作用()、()、/()、/()、/()的代表图像和定量数据 注:/.()()/()/()/().:第 卷第 期 杜思琦等:发光二极管 红光通过/通路抑制滑膜成纤维细胞炎症反应 照射显著抑制/通路上蛋白的表达此外 照射可以促进 在滑膜成纤维细胞中的表达 这些结果表明 照射通过激活 和抑制/信号轴来调节滑膜成纤维细胞增殖讨论类风湿关节炎是一种复杂的以滑膜关节损伤为主要特征的自身免疫性疾病 其中类风湿关节炎滑膜成纤维细胞通过异常增殖、侵袭、抑制细胞凋亡、分泌炎症细胞因子等在滑膜炎症中起中心细胞类型的作用 在本研究中 我们使用 刺激 细胞来模拟 关节的炎症环境 本研究首先选择不同的光照剂量(、和 /)和 内多次照射 探讨 红光对 细胞的光抑制作用 当光照剂量固定在 /时滑膜成纤维细胞的形态无明显变化 细胞增殖受到明显抑制 结合划痕实验结果 整个研究过程中使用的 红光剂量分别为 /和 /在研究 红光照射对 细胞炎症因子的影响时 发现光照剂量为 /时 可以显著抑制炎症因子 和 在 细胞中的表达 这与 等的研究一致 此外 既往研究应用 超脉冲激光和 治疗全髋关节置换术患者的急性疼痛和炎症反应 证实光生物调节疗法通过抑制 和 的表达来减轻炎症和术后疼痛 这些证据表明 低能量光疗可以通过抑制滑膜成纤维细胞的增殖、迁移和炎性细胞因子的分泌 发挥辅助治疗类风湿性关节炎的作用/通路通过整合营养、能量、生长因子等多种细胞外信号 在细胞增殖、凋亡、迁移、恶性转化等多种病理生理过程中发挥重要作用 相关研究发现 异常激活的/通路广泛存在于 滑膜细胞中 与 患者滑膜异常凋亡密切相关 抑制异常激活的通路可诱导滑膜细胞凋亡 对 有明显的治疗作用 在本研究中 为进一步探索 红光照射抑制 细胞的分子机制 使用了/和 /两种光照剂量 蛋白印迹结果显示 当光照剂量为 /时 红光显著抑制 诱导的滑膜成纤维细胞中相关蛋白的表达 提示 红光照射对 诱导的滑膜成纤维细胞增殖的抑制作用 可能与/信号通路密切相关 主要是通过抑制、等关键蛋白的表达和磷酸化水平来实现的为了研究 红光照射对滑膜成纤维细胞 通道的影响 采用蛋白印迹方法检测不同光照剂量对 蛋白的表达 我们发现 红光照射可以促进滑膜成纤维细胞中 的表达 最近的一项研究表明 在 激活的细胞中 抑制/通路可以通过抑制 的核定位和抑制细胞周期进入 期 从而使/直接位于 的下游 此外 在探索 在关节炎中作用的研究中 相关报道表明 是关节炎症和疼痛的重要参与者 是关节疾病的理想治疗靶点 炎症细胞因子如 和 可通过激活 通道介导 从而减少炎症状态下 诱导的 的产生 的适当表达和调控对维持关节健康至关重要 结合以往对 通道作用的研究 我们推测 可能在 红光照射时 通过抑制滑膜细胞增殖和炎症因子合成的过程中起一定作用 总的来说 这些发现表明 红光照射可以通过抑制/通路 抑制 细胞的炎症反应及其增殖和迁移 并且 红光照射可以对滑膜成纤维细胞中 通道产生影响 但其具体作用还有待进一步研究参 考 文 献 .:.():.(/)().():.():.照明工程学报 年 月 .:.():.:.():.():./.():.():.():./:.():.():.().():./.():./.:.:.():.():./.:.:/.():.:.():.:.:.():.():.():.():.():.()().:.