冻融对家兔跟腱生物力学和结构特性的影响.pdf

实用手外科杂志 圆园23 年 9 月 第 37 卷 第 3 期 允韵哉砸晕粤蕴 韵云 孕砸粤悦栽陨悦粤蕴 匀粤晕阅 杂哉砸郧耘砸再 Sep 圆园23熏 灾燥造 37熏 晕燥.3实验研究文章编号院1671-2722渊2023冤03-0414-03冻融对家兔跟腱生物力学和结构特性的影响姜东袁 殷超袁 霍天齐袁 王小龙袁 张国荣袁 王继宏（内蒙古医科大学第二附属医院 手足显微外科中心，内蒙古自治区 呼和浩特 010090）王继宏为本文通讯作者基金项目院内蒙古自治区自然科学基金(项目编号院2020MS08118);内蒙古医科大学青年培育项目渊项目编号院YKD2021QN020冤;内蒙古医科大学致远人才计划治学人才二类专项渊项目编号院ZY0120023冤;内蒙古自治区组织部草原英才创新团队专项基金渊项目编号院CYYCTD2021-8冤;内蒙古自治区科技计划项目渊项目编号院2021GG0206冤;吴阶平医学基金会临床专项资助基金项目渊项目编号院320.6750.2021-4-65冤;内蒙古自治区科技计划项目渊项目编号院2022YFSH0032冤收稿日期：圆园22原10原20作者简介：姜东（1990-），男，主治医师。摘 要院目的探究肌腱多次冻融后是否会影响其自身的特性遥方法肌腱在收获后直接在-20益冷冻袁各组肌腱在 3 个月内进行多次冻融循环袁进行生物力学试验及形态学尧组织学和透射电镜的比较遥结果在-20益的条件下袁随着冻融次数的逐渐增加最大载荷尧抗拉刚度尧最大断裂应力会下降袁同样在组织结构的观察中袁也得到了同样的验证遥结论随着冻融次数的增加袁肌腱的生物力学特征会逐步下降袁组织结构也会受到不同的创伤遥关键词院 冻融曰 肌腱曰 生物力学doi:10.3969/j.issn.1671-2722.2023.03.029The effect of thawing on the biomechanical and structural charaeteristics of rabbit Achilles tendonJIANG Dong,YIN Chao,HUO Tianqi,et al(Department of Hand and Foot Microsurgery,The Second Hospital Affiliated of Inner MongoliaMedical University,Huhhot,Inner Mongolia Autonomous,010090,China)Abstract:Objective To investigate if the repeated thawing can affect the salf chareteristics of rabbit Achillestendon.Methods The tendons were frozen at-20益 directly after harvesting.The tendons in each groupwere subjected to multiple freeze-thaw cycles within 3 months.Biomechanical tests,morphology,histologyand transmission electron microscopy were compared.Results Under the condition of-20益,themaximum load,tensile stiffness and maximum fracture stress decreased with the gradual increase of thenumber of freeze-thawing times,and the same verification was also obtained in the observation of thestructure.Conclusion With the increase of freeze-thaw times,the biomechanical characteristics of thetendon will gradually decrease,and the tissue structure will be affected by different wounds.Key words:Freeze-thaw;Tendon;Biomechanics肌腱是连接肌肉和骨骼的索状或膜状结缔组织，力量传导的中介，肌肉收缩带动肌腱的牵引作用，从而使关节活动。它具有储存弹性势能和承受强负荷牵拉的能力，是关节运动的依赖和基础。肌腱由纵行排列的胶原纤维及散在分布的梭形腱细胞构成。胶原纤维呈线形、螺旋形或交叉方式走行，由纤维细胞基质腱内膜分隔成束，其浅层被覆一单层细胞腱鞘，与肌腱的血管系膜或腱系膜相融合，在腱系膜中有动脉存在。在跨关节活动弧的凹侧，腱鞘纤维滑车防止肌腱收缩时偏移运动中心轴线，以产生更大的活动度，滑车有时可呈不同程度的纤维软骨化生，产生硫酸粘多糖，并可见与关节软骨内排列方式相似的散在分布的许多小胶原纤维。在肌腱损伤愈合的研究中，家兔模型一直被广泛应用，其生物力学检测及组织学观测是对肌腱愈合结果最重要的衡量指标1-2。在完全理想的实验状态下，肌腱应该在新鲜收取后直接进行相关的实验操作。但在实际操作中，则难以实现，多数情况需在低温条件下进行样本保存。尤其是在进行多次、多时间点的实验操作过程中，造模肌腱的保存条件显得414 窑窑实用手外科杂志 圆园23 年 9 月 第 37 卷 第 3 期 允韵哉砸晕粤蕴 韵云 孕砸粤悦栽陨悦粤蕴 匀粤晕阅 杂哉砸郧耘砸再 Sep 圆园23熏 灾燥造 37熏 晕燥.3格外重要。然而，目前还没有研究显示冻融家兔肌腱是否会影响其自身的特性及相关的实验结果，因此我们设计并执行该实验以探究多次冻融肌腱对其特性的影响。1 材料与方法1.1 组织材料提取与分组成年健康雄性新西兰白兔 64 只，体重 2.02.5 kg，6 个月龄。取左跟腱和 10.0 mm 附着的肌肉(腓肠肌和比目鱼肌)；整个脚在踝关节处被分离。跖腱被完全切除。按生物力学试验和组织学样本随机分组：新鲜组，5 次冷冻循环组(-205)，10 次冷冻循环组(-2010)。新鲜的样品立即进行了检测，冷冻组的标本用盐水浸湿纱布包好，置于 15 mLFalcon tubes 中，按组在-20下立即冷冻。短期冷冻组样品至少冷冻 48 h，室温(21)解冻 4 h；人工确认完全解冻。最后一个解冻周期发生在测试之前。肌腱长度和横截面积(CSA)由单一、一致的操作人员(SAM)使用高精度标卡尺测量。1.2 生物力学测试利用生物力学测定仪测定，取腓肠肌对跟腱的牵引力的平均值。首先用游标卡尺测出跟腱标本的横向宽度，再用自制恒压式横截面积测量仪测出断裂修复组织厚度(压强为 0.12 mPa、时间为 2 min)，计算出各取材标本肌腱横截面积。把标本两端用桶形卡具加横行钢钉固定，牙膏粉包埋。放置标本与MTS 858 生物材料测试机上做拉伸试验。拉力达到2.0 N 时用电子游标卡尺测量肌腱的长度。先行预处理，拉伸速度 O.5 mm/s，拉长 O.5 mm，共 3 次，然后行拉断试验，拉伸速度为 500 mm/min，并进行最大强度、最大值载荷以及刚度等生物力学指标计算。1.3 组织学检测选取的各组家兔肌腱(新鲜，-205，-2010)进行固定，10%中性缓冲福尔马林附着跟骨脱钙。纵向部分(5 m)分别用苏木精伊红(H&E)或天狼猩红染色描述性分析。1.4 电子显微镜检测选取各组(新鲜，-205，-2010)样品在Trumps 固定剂中固定。将超薄切片(100 nm)安装在200 目铜网上，用柱上柠檬酸铅染色，在 JEOLJEM-1400 透射电镜下观察。1.5 统计学分析所有数据均以均数标准差（）形式表示，采用 SPSS 20.0 统计软件分析处理。多组比较采用方差分析，两两比较采用 SNK 法。以0.05 为差异具有统计学意义。2 实验结果2.1 力学结果最大载荷（N）新鲜组相比-205组和-2010 组有统计学意义，0.05；抗拉刚度(N/mm)新鲜组相比-205 组和-2010 组有统计学意义，0.05；最大断裂应力(mPa)新鲜组相比-205 组和-2010 组有统计学意义，0.05（表 1）。2.2 HE 染色结果新鲜肌腱胶原纤维束排列整齐，结构清楚，腱细胞均匀分布，细胞核清晰可见；5 次冻融循环后与新鲜肌腱比较，胶原纤维束排列紊乱，结构欠清，出现裂隙，腱细胞排布稍紊乱；10 次冻融循环后与新鲜肌腱比较，胶原纤维发生皱缩、断裂，排列紊乱，纤维束间间隙增大，如图 1-3（100）。2.3 电子透镜结果新鲜组胶原纤维平行排列，有明显的横带周期；5 次冻融，胶原纤维出现肿胀变粗，排列混乱，横带周期不明显；10 次冻融，出现纤维断裂（图 4-6）。3 讨论我们思考一个问题，随着冻融次数的增加，是否会影响肌腱自身的组织结构和力学性质。本实验以这个问题切入，实际操作并加以验证，实验结果告诉我们，在-20的条件下，随着冻融次数的逐渐增加最大载荷、抗拉刚度、最大断裂应力会下降。同样在组织结构的观察中，也得到了同样的验证。图 1 新鲜组 HE 染色图 3 10 次冻融染色图 2 5 次冻融染色表 1兔跟腱最大载荷尧抗拉刚度尧最大断裂应力比较（依）最大载荷（N）抗拉刚度(N/mm)最大断裂应力(mPa)新鲜组269.32 8.5248.630.679.781.11-205 组213.56 2.85a42.530.67a8.990.39-2010 组 189.4520.89a37.140.11a6.460.47a注院a与新鲜组比0.05图 4新鲜组电镜图 5 5 次冻融电镜图 6 10 次冻融电镜415窑窑实用手外科杂志 圆园23 年 9 月 第 37 卷 第 3 期 允韵哉砸晕粤蕴 韵云 孕砸粤悦栽陨悦粤蕴 匀粤晕阅 杂哉砸郧耘砸再 Sep 圆园23熏 灾燥造 37熏 晕燥.3如今该领域的相关研究中，学者们的关注点主要是人类的同种异体肌腱的保存，对于新鲜肌腱的保存研究甚少。然而保存在-20或-80条件下的肌腱，有或没有光照，根据实验要求进行反复冻融，对于模型肌腱自身的影响，却有一些相关的报道。比利时鲁汶大学医学院骨科教授 Nele Arnout 等3在对肌腱生物力学研究中发现,肌腱可以在-80下冷冻，并在室温下多次解冻，而不改变其生物力学特性。美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所康复医学研究中心教授 NP Quirk 团队在研究大鼠时发现：大鼠跟腱在-20或-80条件下短期冷冻 12 次(最多 3 个月)，但是在-20或-80下冷冻 9 个月会导致肌腱的某些实验数值异常4。在相关学者的研究中将新鲜组织与解冻的标本进行比较的实验数据是有显著差异的。青岛大学医学院附属医院关节外科 Huang 教授等5在-80条件下对人屈肌腱进行多达 10 个周期的冻融，每次冻融持续 4 d，在到 5 个或 10 个周期后强度和刚度与对照组的新鲜肌腱相比出现明显下降。同样该医院Ren 教授等在测试人体屈肌腱时发现，在-80下冷冻 7 d，在 25下解冻 6 h，经过 4 次循环后，极限载荷和刚度降低。该医院医用材料研究中心石新艳教授团队在研究尸体肌腱时发现，与新鲜组相比，拉断试验中冻融 5 次组与冻融 10 次组最大负荷、最大应力均明显减小，差异均有统计学意义（0.05），但最大拉伸及最大应变差异均无统计学意义（0.05）。应力松弛试验中，冻融 5 次组与冻融 10 次组应力松弛下降速度较快，与新鲜组相比差异均有统计学意义（0.05）。蠕变试验出现相似结果，冻融5 次组与冻融 10 次组在 100 N 拉力作用下更早松弛，产生的蠕变较大，与新鲜组相比差异有统计学意义（0.05）。冻融 1 次、2 次、3 次组各指标与新鲜组比较差异均无统计学意义（0.05）。对同种异体移植物经深低温冻存后，冻融周期不宜超过 3个，多周期反复冻融将削弱同种异体肌腱的生物力学性质，使其更容易疲劳、断裂。波兰克拉科夫科技大学机械与机器人学院学者 Martyna Ekiert 等6研究发现，多次冻融循环影响组织的粘弹性和结构性能，在第 3 或第 4 次冻融循环后，显著降低其拉伸模量，第 8 次冻融循环后松弛时应力下降，第 10 次冻融循环后机械迟滞，并导致胶原原纤维直径显著减 小。德 国 莱 比 锡 大 学 动 物 研 究 所 SusannePauline Roth 教授等7在研究脱细胞肌腱时发现，在经过反复冻融循环后，肌腱的刚性较新鲜肌腱属性显著下降。但也有学者研究发现，在冷冻开始 30min 后，肌腱细胞开始出现死亡。美国特拉华大学生物医学工程系 Andrea H Lee 教授及其团队8研究肌腱损伤和机械负荷关系时也证实了上述结论。我们的实验存在以下不足：仅仅只是研究了3 个时间点，即新鲜、5 次冻融、10 次冻融，实验结果受到连续性冻融次数的限制，不够全面；只是选择了-20的储存条件，没有-80的储存条件；仅考虑短期 3 个月内的冻融，没有考虑 6 个月以上的冻融。所以在后续实验过程中，我们需要加以补充和完善，以期得到更加全面的实验数据。参考文献院1 王博，白胜超，李文博，等.高强度跳跃肌腱损伤即刻冷水浸没干预模型兔髌腱组织内的炎症反应和胶原重塑J.中国组织工程研究，2021，25(29)：4619-4625.2 张培，刘泉，樊宗庆，等.带肌腹血供腓骨长肌腱移植重建对兔前交叉韧带止点转归影响的研究J.中国修复重建外科杂志，2020，34(7)：848-853.3 Arnout N,Myncke J,Vanlauwe J,et al.The influence offreezing on the tensile strength of tendon grafts:Abiomechanical studyJ.Acta Orthopaedica Belgica,2013,79(4):435.4 Quirk NP,Lopez D,De L,et al.Effects of freeze-thaw onthe biomechanical and structural properties of the ratachilles tendonJ.Journal of Biomechanics,2018,81（16）：52-57.5 Huang H,Zhang J,Kang S,et al.Effects of repetitive mu-ltiple freeze-thaw cycles on the biomechanical prope-rties of human flexor digitorum superficialis and fl-exor pollicis longus tendonsJ.Clinical Biomechanics,2011,26(4):419-423.6 Me A,Jk B,Us B,et al.The effect of multiple freeze-thaw cycles on the viscoelastic properties and micro-structure of bovine superficial digital flexor tendonJ.Journal of the Mechanical Behavior of BiomedicalMaterials,2021,120(8):104582.7 Roth SP,Glauche SM,Plenge A,et al.Automated freeze-thaw cycles for decellularization of tendon tissue-a pilot studyJ.Bmc Biotechnology,2017,17(1):103-108.8 Lee AH,Szczesny SE,Santare MH,et al.Investigating me-chanisms of tendon damage by measuring multi-scalerecovery following tensile loadingJ.Acta biomateri-alia,2017,57(15):363-372.416 窑窑