GBT14926.43-2001实验动物细菌学检测染色法培养基和试剂国家标准规范.pdf

I CS 6 5I 3 4 40 2 0.3 0词臀中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂L a b o r a t o r y a n i ma l-B a c t e r i o o g i c a l mo n i t o r i n g-S t a i n i n g,m e d i a a n d r e a g e n t s2 0 0 1-0 8-2 9 发布2 0 0 2-0 5-0 1 实施中华人民共和匡国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 婿GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1前言 本标准规定了实验动物微生物学检测的染色法、培养基和试剂。在以前的相关标准中对染色法、培养基和试剂的具体内容没有进行描述，基本上是引用 GB 4 7 8 9.4-1 9 9 4 食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验),GB 4 7 8 9.1 0 一工 9 9 4(食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验),G B 4 7 8 9.工 工-1 9 9 4 食品卫生微生物学检验溶血性链球菌检验 和 G B 4 7 8 9.2 8-1 9 9 4 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 中相关内容，给本标准的使用造成不便。为将染色法、培养基和试剂的配制方法和操作程序标准化并便于查找，特制定本标准。本标准由中华人民共和国科学技术部提出并归口。本标准起草单位:中国实验动物学会。本标准主要起草人:李红、黄韧、范薇。中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1La b o r a t o r y a n i ma l-B a c t e r i o l o g i c a l mo n i t o r i n g -S t a i n i n g,me d i a a n d r e a g e n t s范围本标准规定了各种染色法、培养基和试剂。本标准适用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、兔、犬、猴的细菌学检测。2原理 实验动物微生物从培养基中摄取营养物质，维持正常的生长繁殖和代谢，其所含细胞物质能与各种染料结合，呈现不同颜色。3 染色液的配制和染色法3.1 革兰染色法3.1.1 结晶紫染色液 结晶紫1g 9 5%乙醇2 0 mL 1%草酸钱水溶液8 0 mL 将结晶紫在乳钵内研磨，用乙醇溶解，加人草酸按水溶液混合，即可使用。3.1.2 碘液 碘1g 碘化钾29 蒸馏水3 0 0 mL 将碘化钾与碘先用少量水溶解，待全部溶解后，加蒸馏水至 3 0 0 mL,3.1.3 脱色液 9 5%乙醇3.1.4 沙黄(番红)复染液 沙黄0.2 5 g 9 5%乙醇1 0 mL 蒸馏水9 0 mL 将沙黄在乳钵内研磨.用乙醇溶解，加人蒸馏水混合，即可使用。3.1.5 染色法3.1.5.1 涂片风干后在火焰上固定。3.1.5.2 滴加结晶紫染色液，染色 1 min，流水冲洗，甩干。中华人民共和国国家质It监督检验检疫总局2 0 0 1-0 8-2 9批准2 0 0 2-0 5-0 1实施 1GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 13.1.5.3 滴加碘液，媒染 1 mi n，流水冲洗，甩干。3.1.5.4 滴加9 5%乙醇脱色约 1 5 3 0 s，流水冲洗，甩干。3.1.5.5 滴加沙黄复红染液，染色1 mi n，流水冲洗，甩干，风干或滤纸吸干后镜检。3.1.6 结果 使用油镜放大 1 0 0 0 倍观察，革兰阳性菌呈蓝紫色，革兰阴性菌呈红色。3.2 姬姆萨染色法3.2.1 姬姆萨染液3.2.1.1 储存液 姬姆萨粉末。.5 9 甘油(中性)2 5 mL 甲醇2 5 mL 将姬姆萨粉于研钵内，先加少许甘油研磨，至甘油加完为止，倒人棕色试剂瓶中，再用少量甲醇加人研钵内，逐渐将甘油洗下，倒人试剂瓶内，直至用甲醇洗净研钵体内甘油为止。并将剩余甲醇一并加人瓶中，塞紧瓶盖，充分摇匀，置 6 0 0C温箱内2 4 h 或室温一周后即可使用。3.2.1.2 应用液 使用前储存液用 p H7.2-7.4 P B S 1 0 倍稀释即成。3.2.2 染色法 涂片或压印片风干后用甲醇固定 5 mi n后滴加姬姆萨应用液，染色2 0-3 0 m i n，用流水冲洗，甩干，风干或滤纸吸干后镜检。3.2.3 结果 使用油镜放大 1 0 0 0 倍观察，组织、脓汁或红细胞呈红色，细菌呈紫色。3.3 英膜染色法3.3.1 染色液 甲醛中加人 2%印度黑汁;革兰染色液中的沙黄复染液。3.3.2 染色法3.3.2.1 取一接种环肉汤培养物于载玻片上，再取一接种环甲醛印度黑汁与其混匀，推成薄片，自然干燥后火焰固定。3.3.2.2 滴加沙黄复染液，染色3 0 s，吸去多余液体，干燥后油镜观察。3.3.3 结果使用油镜放大 1 0 0 0 倍观察，细菌周围有透明带者为英膜染色阳性。3.4 支原体菌落染色法3.4.1 染色液(D i e n e s 染色液)美兰2.59 刃天青(a z u r e)1.2 5 g 麦芽糖1 0.0 g 苯甲 酸。.2 9 蒸馏水1 0 0 mL3.4.2 染色方法 临用前将染色液用蒸馏水稀释 1 0 0 -3 0 0 倍，滴加到疑似有支原体菌落的平皿中，使其铺满个平皿，不断摇动，1 5 min后倒掉染色液，用 p H7.4 P B S 洗 3 次。3.4.3 结果 平皿置解剖镜或低倍镜下观察，支原体菌落呈蓝色，L型细菌菌落在短时间内能染上蓝色，但 3 0-6 0 m i n后褪色，呈无色。GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 013.5 乳酸酚棉蓝染色液3.5.1 染色液 结晶酚2 0 g 乳酸2 0 mL 甘油4 0 mL 蒸馏水2 0 mL 棉蓝0.0 5 g 除棉蓝外，其余成分混匀后水浴加热，充分搅拌直至完全溶解，然后加人棉蓝，混合均匀，必要时过滤，瓶装备用3.5.2 染色方法:取载玻片并加染色液数滴，用接种针(环)取培养物置于染色液中，然后加盖玻片，静置 1 0 mi n 后，吸去周围染液，用高倍镜检查。3.5.3 结果:真菌菌体呈蓝色。3.6 鞭毛染色液3.6.1 染色液3.6.1.1 甲液:单宁酸5 g,氯化高铁(F e C l,)1.5 g 溶于1 0 0 m L 蒸馏水中，待溶解后加人1%的氢氧化钠溶液 1 mL和 1 5%的甲醛溶液 2 mL.3.6.1.2 乙液:2 g硝酸银溶于 1 0 0 mL蒸馏水中。在 9 0 mL乙液中滴加浓氢氧化按溶液，到出现沉淀后，再滴加使其变为澄清，然后用其余 1 0 m L乙液小心滴加至澄清液中，至出现轻微雾状为止，(此为关键性操作，应特别小心)，滴加氢氧化按和用剩余乙液回滴时，要边滴边充分摇荡，染液当天配，当天使用。3.6.2 染色法:在风干的载玻片上滴加甲液 4-6 mL后，用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液，缓缓加热至冒气，维持约3 0 s(加热时注意勿使出现干燥面)，在菌体多的部位可呈深褐色到黑色，停止加热，用水冲净，烘干镜检。3.6.3 结果:用油 镜放大1 0 0 0 倍观察，菌体及鞭毛呈深褐色或黑色。3.7 氢氧化钾二甲基亚矾液3.7.1 成分 二甲基亚矾(D MS O)4 0 mL 氢氧化钾1 0-2 0 g 蒸馏水6 0 mL3.7.2 制法:将D M S O与 蒸馏水混匀后加人氢氧化钾，置棕色瓶中 备用。4 一般培养基、选择性培养基和鉴定用培养基4.1 牛肉浸液培养基4.1.1 成分 新鲜除脂牛肉5 0 0 g 氯化钠5g 蛋白陈1 0 g 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.4 一7.64.1.2 制法 将完全除去脂肪、肌腔和筋膜的牛肉5 0 0 g，加蒸馏水 1 0 0 0 mL，充分搅拌后置 4 冰箱过夜。次日煮沸 3 0 mi n，并不时搅拌。用绒布或多层纱布粗过滤，再用脱脂棉过滤即成。在滤液中加人其他成分溶解后用氢氧化钠 溶液矫正p H至8.0，并煮沸1 0 m i n，补充蒸馏水至1 0 0 0 m L p H有明 显下降时 再矫 3GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 01正至 7.6-7.8，最后用滤纸过滤，呈清晰透明、淡黄色液体，1 2 1 C灭菌 1 5 mi n备用，此时的 p H值应该是 7.4-7.6.4.2 营养肉汤4.2.1 成分 蛋白 陈1 0 g 牛肉膏3 9 氯化钠5 9 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.44.2.2 制法 将上述成分称量混合溶解于水中，校正p H至7.4，分装中试管，每管 5 m L,1 2 1 灭菌 1 5 m i n,置4 冰箱保存，两周内用完。4.3 普通营养琼脂4.3.1 成分 营养肉汤中加人 1.2%-1.5%的琼脂。4.32 制法 煮沸溶解琼脂后 1 2 1 灭菌 1 5 mi n.待冷至 5 0 左右时倾注无菌平皿，凝固后置 4 C冰箱保存，两周 内用完。4.4 血琼脂4.4.1 成分 营养琼脂中加人 5%-1 0%的脱纤维羊血。4.4.2 制法 待已灭菌的营养琼脂冷至 5 0 左右时以无菌手续加人血液，轻轻摇匀后倾注平皿，凝固后置 4 冰箱保存，一周内用完。4.5 半固体琼脂4.5.1 成分 营养肉汤中加人。3%的琼脂。4.5.2 制法 加热煮沸，待琼脂溶化后分装小试管，每管2 mL.塞上透气塞，1 2 1 灭菌1 5 mi n，直立放置，冷却后4 冰箱保存，两周内用完。4.6 D HL琼脂(胆盐硫乳琼脂培养基)4.6.1 成分 蛋白 陈2 0 9 牛肉膏39 乳糖1 0 g 蔗糖1 0 g 去氧胆酸钠19 硫代硫酸钠2.3 9 构椽酸钠1 9 水解酪蛋白5 9 构椽酸铁馁1 9 1 肠中性红3 mL 琼脂粉1 59GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 01 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.44.6.2 制法 除1%中性红溶液及琼 脂外，上述成分混和，微温 使溶解，调节p H值至7.4，加人琼脂，加热煮沸溶化后再加人中性红溶液，摇匀，冷至约 5 0 -5 5 时倾注平皿。凝固后放置4 冰箱保存，两周内用完。4.7 S S琼脂4.7.1 成分 蛋 白脉5g 牛肉膏5g 乳糖1 0 g 胆盐(3 号)3.5 g 构椽酸钠(H 2 O)8.5 g 硫代硫酸钠8.5 g 构穆酸铁按1 g 1 洲中性红溶液2.5 mL 。1%亮绿溶液。.3 3 mL 琼脂5-2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.0一7.24.7.2 制法 除中性红、亮绿及琼脂外，混和其他成分，加热溶解，调节 p H值，加人琼脂，加热溶化，再加人中性红和亮绿摇匀，冷至约 5 5-6 0 时倾注平皿。凝固后放置 4 冰箱保存，一周内用完。4.8 麦康凯琼脂4.8.1 成分 蛋白 陈2 0 g 氯化钠5g 胆盐(猪、牛等)5 g 乳糖1 0 g 琼脂1 5 2 0 g 1 写中性红溶液5 mL 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.24.8.2 制法 将上述成分(中性红和琼脂除外)混合，加热溶解，校正 p H，加人琼脂，煮沸溶化后再加人中性红溶液，摇匀，1 1 5 灭菌2 0 m i n，待冷至5 0 -5 5 时倾注平皿。凝固后置4 冰 箱保存，一周内使用。4.9 亚硒酸盐增菌液(S F)4.9.1 成分 蛋白脉5g 乳糖4 g 磷酸氢二钠4.5 g 磷酸二氢钠5.5 g 亚硒酸氢钠4g 蒸馏水1 0 0 0 mL 5GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 01 p H7.0-7.24.9.2 制法 先将亚硒酸盐加到 2 0 0 mL蒸馏水中，充分摇匀溶解。混合其它成分，加人蒸馏水 8 0 0 m L，加热溶解，待冷却后两液混合，充分摇匀，校正p H值(调整磷酸盐缓冲对的比例来校正)。最后分装中试管，每管 5 mL，置水浴隔水煮沸 1 0 1 5 mi n，立即冷却，4 冰箱保存，一周内使用。4.1 0 李氏增菌肉汤(L B 1,L B 2)4.1 0.1 成分 胰蛋白膝59 多价陈5g 酵母浸膏5 9 氯化钠59 磷酸二氢钾1.3 5 g 磷酸氢二钠1 2 g 七叶昔1 g 蒸馏水1 0 0 0 mL4.1 0.2 制法 将上述成分加热溶解，调 p H至7.2-7.4，分装，1 2 1 0C 1 5 mi n 灭菌。LB1:2 2 5 mL中加人1 写蔡陡酮酸(用 0.0 5 m o l/L氢氧化钠溶液配制)0.4 5 mL 1%丫 咙黄(用灭菌蒸馏水配 制)0.2 7 m L L BZ:2 0 0 mL中加人1 纬禁吮酮酸0.4 0 mL 1%丫陡黄。5 0 mL 分装中 试管，每管5 m L,4.1 1 改良的Mc B r i d e 琼脂(MMA)4.1 1.1 成分 胰蛋白 脉5 9 多价脉59 牛肉膏3g 葡萄糖19 抓化钠5g 磷酸氢二钠1 9 苯乙醇2,smL 无水甘氨酸1 0 g 氯化铿0.5 9 琼脂1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 mL pH7.2-7.44.1 1.2 制法 除琼脂外混合上述成分，加热溶解，校正p H后再加人琼脂，煮沸溶化，1 2 1 灭菌1 5 m i n，待冷却至5 0-5 5 时倾注平皿，凝固后冷藏备用。4.1 2 C a r y-S t a i r 氏运送培养基4.1 2.1 成 分GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1 硫乙醇酸钠1.5 9 磷酸氢二钠1.1 g 氯化钠59 琼脂5g 蒸馏水1 0 0 0 mL 1%氯化钙溶液9 ml-p H8.44.1 2.2 制法 除氯化钙外混合其他成分，加热煮沸溶解，冷至 5 0 时加人氯化钙溶液，校正 p H。分装中试管，每管 5 mL，加胶塞，1 2 1 灭菌 1 5 m i n a4.1 3 改良磷酸盐缓冲液4.1 3.1 成分 磷酸氢二钠8.2 3 g 磷酸二氢钠(N a H,P q 1 2 H,0)1.2 g 氯化钠59 三号胆盐1.59 山梨醇2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 mL4.1 3.2 制法 将磷酸盐及氯化钠溶于蒸馏水中，再加人其余成分，溶解后校正 p H7.6，分装中试管，每管 5 mL,1 2 1 灭菌 1 5 mi n备用。4.1 4 C I N-1 培养基4.1 4.1 基础培养基 胰蛋白膝2 0 g 酵母浸膏29 甘露醇2 0 g 氯化钠1g 去氧胆酸钠29 硫酸镁(Mg S 0 4 7 H2 0)0.0 1 g 琼脂1 2 9 蒸馏水9 5 0 m L p H7.4-7.64.1 4.2 I r g a s a n:以9 5%乙醇作溶剂，溶解二苯醚，配成。.4%的溶液，待基础培养基冷至 8 0 C时加人1 m L 混匀。4.1 4.3 冷至5 0 时加人 中性红(3 m g/mL)1 0 mL 结晶紫(0.1 mg/mL)1 0 m L 头抱菌素(1.5 m g/m L)1 0 m L 新生霉素(0.2 5 m g/m L)1 0 m L 最后不断搅拌着加人 1 0 mL 1 0 0 o 氯化银溶液，倾注平皿，凝固后冷藏备用。4.1 5 改良Y培养基4.1 5.1 成分 蛋白陈1 5 g 7GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1 氯化钠5 9 乳糖1 0 g 草酸钠29 去氧胆酸钠69 三号胆盐59 丙酮酸钠2 9 孟加拉红4 0 m g 水解酪蛋白5 9 琼脂1 7 g 蒸馏水1 0 0 0 mL4.1 5.2 制法 混合上述成分，加热煮沸溶解后 1 2 1 灭菌 1 5 m i n,冷至5 0-5 5 时倾注平皿，凝固后冷藏备用4.1 6 葡萄糖蛋白陈琼脂(沙氏培养基)4.1 6.1 成分 蛋白 脉1 0 g 葡萄糖4 0 g 琼脂1 8 g 蒸馏水1 0 0 0 mL4.1 6.2 制法 加热溶解调p H至 5.6，分装大号中试管，1 0 mL/管，1 1 6 灭菌 3 0 mi n 后放成斜面，凝固后冷藏备用。4.1 7 皮肤癣菌鉴别琼脂(D T M)4.1 7.1 成分 蛋白 脉1 0 g 葡萄糖2 0 g 酚红(0.2 写)6 ml 盐酸(0.6 m o l/L)6 mL 琼脂1 8 g 蒸馏水1 0 0 0 mL 抗生索:氯霉素4 0 m g 或金霉素1 0 0 m g 硫酸庆大霉素1 0 0 m g4.1 7.2 制法 除抗生素外，其他成分加热溶解调 p H至5.5,1 2 1 灭菌 1 5 mi n 备用将抗生素制备成溶液后，过滤除菌，使用前临时加人。在室温中制成斜面。4.1 8 支原体半流体培养基4.1 8.1 成分 含0.3 写琼脂的支原体基础培养基(支原体液体培养基干粉，按使用说明书称量、并加人。.3%琼脂，配制)3.5 mL 马血清1.0 mL 醉母浸出液0.5 mL 青霉素添加液。.2 5 mL 乙酸铭添加液。.1 mLGB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 014.1 8.2 制备方法:各种成分均需分别制备，使用时按上述比例混合。4.1 8.2.1 含。.3 环琼脂的支原体基础培养基:按使用说明书称量并加人琼脂，蒸馏水煮沸溶解，分装中试管，每管 3.5 mL，用胶塞塞紧后灭菌 4 保存备用。4.1 8.2.2 马血清:市售马血清经 5 6 C 3 0 mi n 灭活后一2 0 保存4.1 8.2.3 酵 母浸出 液:市售酵母浸出 粉用蒸馏水配制成7%的溶液，0.2 2 p m滤膜过滤除菌，小量分装一2 0 保存。使用时分装小试管，每管。.6-0.7 ml，用于咽及气管洗脱液的制备。4.1 8.2.4 青霉素添加液:注射用青霉素钾盐或钠盐用灭菌蒸馏水配制成每毫升含 1 万 U的溶液，小量分装一2 0 保存。4.1 8.2.5 乙酸铭添加液:乙酸铂 1 g溶于 1 0 0 ml灭菌蒸馏水中，小量分装一2 0 C 保存。4.1 8.3 使用:基础培养基溶化后置 5 0 水浴中，将马血清、青霉素添加液及乙酸铭添加液根据需要量按上述比 例混合作为总添加液，取出冷至5 0 的基础培养基，分别加人总添加液1.3 5 m L、用酵母浸出液制成的洗脱液 0.5 mL,混匀后即可培养。4.1 9 支原体液体培养基4.1 9.1 成分 支原体基础培养基 (干粉，按使用说明书称量、配制)3.5 mL 马血清1.0 mL 酵母浸出液0.5 mL 青霉素添加液0.2 5 mL 乙酸铂添加液。.1 mL4.1 9.2 制法 支原体基础培养基:按使用说明书称量，加人蒸馏水煮沸溶解，分装中试管，每管3.5 mL，用胶塞塞紧后灭菌 4 保存备用。临用时将各种成分混均即可。4.2 0 支原体固体培养基4.2 0.1 成分 支原体固体培养基基础 (干粉，按使用说明书称量、配制)7 0 m L 马血清2 0 mL 酵母浸出液1 0 mL 青霉素添加液5 mL 乙酸蛇添加液2.5 mL4.2 0.2 制法 固体培养基基础冷至 5 0 时加人各种添加液，混匀后倾注无菌平皿，凝固后用保鲜袋保装后置 4 C保存，一周内使用。4.2 1 高盐甘露醇琼脂(S P)4.2 1.1 成分 牛肉膏19 蛋白 陈或多 价脉1 0 g 氯化钠7 5 g 甘露醇1 0 g 酚红0.0 2 5 g 琼脂1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 mL 9GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 01 pH7.44.2 1.2 制法 除酚红和琼脂外混合上 述成分，加热溶解，校正p H至7.4，加人酚红，1 1 5 灭菌1 5 m i n，冷至5 0-5 5 0C 时倾注平皿，凝固后冷藏，两周内使用。4.2 2 葡萄糖肉浸液肉汤4.2 2.、成分 牛肉浸液培养基中加人 1%葡萄糖。4.2 2.2 制法 待葡萄糖完全溶解后先后装中试管，每管5 mL,1 1 5 灭菌2 0 mi n。也可用少量已灭菌的牛肉浸液溶解葡萄糖，过滤除菌后混合，摇匀，分装。4.2 3 链球菌增菌肉汤4.2 3.1 成分 胰蛋白陈1 5 9 大 豆陈59 氯化 钠4g 柠檬酸钠(C H,N a,0 7 2 H,0)1 g 1-胧氨酸0.2 g D葡萄糖59 亚硫酸钠。.29 三氮化钠。2 g 结晶紫0.0 0 0 2 g 蒸馏水1 0 0 0 mL p H 7.3-7.54.2 3.2 制法 除结晶紫外，将其它成分混合，加热溶解调 p H至 7.3-7.5，加人结晶紫，混匀，分装，经 1 1 6 C,1 5 mi n 高压灭菌，以无菌手续加其余成分，摇匀，分装中试管，每管5 mL，冷藏备用。4.2 4 NA C增菌液4.2 4.1 成分 磷酸氢二钾。39 硫酸镁(Mg S O,7 H2 0)0.3 g 蛋白 脉2 0 g 十六烷三甲基澳化按。29 禁咤酮酸1 5 m g 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.64.2 4.2 制法 除十六烷三甲 基澳化铁外，将上述成分混合、溶解，用5 m o l/L氢氧化钠溶液调p H至7.4-7.5后，加人十六烷三甲基澳化按溶解后分装中试管.每管 5 m L,1 2 1 灭菌 1 m i n，冷却后冷藏备用。4.2 5 N AC琼脂4.2 5.1 成分 NA C液体培养基1 0 0 0 mL 琼脂1 5 94.2 52 制法 1 0GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1 将琼脂加人:V AC液体培养基中，1 2 1 灭菌 1 mi n，冷至 5 0-5 5,C，倾注平皿，凝固后冷藏备用。4.2 6 改良C a m p-B A P培养基4.2 6.1 成分4.2 6.1.1 基础培养基 胰蛋白 陈1 0 g 蛋白 脉1 0 g 葡萄糖19 酵母浸膏2 9 氯化钠59 焦亚硫酸钠。.1 9 硫乙醇酸钠1.5 9 琼脂1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 mL4.2 6.1.2 抗生素添加剂 万古霉素。.0 1 g 多粘菌素 B 2 5 0 0 I U 两性霉素B 0.0 0 2 g 头抱菌素0.0 1 5 g4.2 6.1.3 脱纤维羊血 5 0 mL.4.2 6.2 制法 混合基础培养基成分，加热溶解，校正 p H至 7.0，分装，1 2 1 灭菌 1 5 m i n，冷至5 0 C时加人抗生素添加剂及脱纤维羊血，摇匀后倾注平皿，凝固后冷藏备用。4.2 7 S k ir r o w氏培养基4.2 7.1 成分4.2 7.1.1 基础培养基 蛋白陈1 5 g 胰蛋白豚5 9 酵母浸膏59 氯化 钠5g 琼脂1 2 g 蒸馏水1 0 0 0 mL4.2 7.1.2 甲氧节氨啼咙(T MP)、抗生素 万古霉素1 0 m g 多粘菌素B 2 5 0 0 I U 甲氧节氨啼咙(T MP)5 mg4.2 7.1.3 脱纤维羊血 7 0 mL.4.2 7.2 制法4.2 7.2.1 TMP、抗生素添加液。4.2 7.2.1.1 乳酸6 2 mg(约 2滴)加人 1 0 0 mL灭菌蒸馏水中，然后加人 T MP 1 0 0 mg，煮沸。4.2 7.2.1.2 取上述溶液5 mL加人万古霉素和多枯菌素B,摇匀后即成。4.2 7.2.2 混合基础培养基各成分加热溶解，调 p H至 7.2，分装，每瓶 1 0 0 m L,1 2 1 C l 5 mi n 灭菌，冷藏备用。临用前加热溶解，冷至 5 0 时每 1 0 0 m l中加人脱纤维羊血 7 ml.,T MP、抗生素添加液 0.5m L摇匀，倾注平皿。l 1GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 14.2 8 脑心浸液肉汤4.2 8.1 成分 脑浸液干粉1 2.5 g 心浸液干粉59 胰蛋白陈1 0 g 氯化钠59 葡 萄糖29 磷酸二氢钠(无水)2.59 蒸馏水1 0 0 0 ml p H7.44.2 8.2 制法 混合上述成分，加热溶解后调整 p H值，分装中试管，每管5 mL，使用透气塞，1 2 1 灭菌 1 5 mi n，冷却后冷藏，一周内使用。4.2 9 硫乙醇酸钠肉汤4.2 9.1 成分 酵母浸出粉59 胰蛋白 陈1 5 g 葡萄糖5.5 g 硫乙醉酸钠0.59 氯化钠2 5 g 刃天青0.0 0 1 g 琼脂0.59 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.24.2 9.2 制法 混合上述成分，煮沸溶解，调整 p H 值，分装中试管，每管 5 mL，使用不透气胶塞，1 2 1 灭菌1 5 m i n，冷却后冷藏，一周内使用。4.3 0 大豆蛋白陈肉汤4.3 0.1 成分 胰酶消化酪蛋白1 7 g 木瓜酶消化大豆粉3 9 氯化钠59 磷酸氢二钾2.5 9 葡萄糖25g 蒸馏水1 0 0 0 m L p H7.34.3 0.2 制法 混合上述成分，加热溶解，调整 p H值，分装中试管，每管 5 mL，使用透气塞，1 2 1 0C 1 5 mi n灭菌，冷却后冷藏，一周内使用。5 生化培养基和血清学试剂糖醇发酵培养基 基础液成分月.口.户7 .-1土J工OGI 3/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1 牛肉膏5 9 蛋白脉1 0 g 氯化钠39 磷酸氢二钠(N a,H P O,1 2 H,0)2 g 0.2%澳察香草酚蓝溶液1 2 mL 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.45.1.2 制法 在基础培养基中加人。.5%的葡萄糖,0.1%的其他糖醇.溶解后分装小试管，其中葡萄糖发酵管中倒置一个小管,1 1 5 0C2 0 mi n灭菌，冷却后冷藏备用。5.2 氨基酸脱梭酶试验培养基5.2.1 成分 蛋 白陈59 酵母浸出粉39 葡萄糖1 g 1.6%澳甲酚紫乙醇溶液1 mL 蒸馏水1 0 0 0 mL L-氨基酸。.5 g/1 0 0 m L 或 D L氨基酸1 g/1 0 0 m L p H6.85.2.2 制法 除氨基酸以外的成分混和，加热溶解后分装，每瓶 1 0 0 mL，分别加人各种氨基酸:赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸，再校正p H至 6.8，同时用不加氨基酸培养基作对照。分装于灭菌的小试管内，每管 3 mL，并加一层液体石蜡，1 2 1 灭菌1 0 m i n.5.3 苯丙氨酸培养基5.3.1 成分 酵 母浸膏3 g 氯化钠59 D,L-苯丙氨酸2 g (或 L 一 苯丙氨酸 1 g)琼脂1 2 g 蒸馏水1 0 0 0 mL 磷酸氢二钠1 95.3.2 制法 将上述成分加热溶解，分装试管，1 2 1 灭菌 1 5 mi n，置成斜面。5.3.3 试剂 1 0 纬三氯化铁溶液。5.3.4 使用方法 挑取琼脂培养物沿斜面划线接种，(3 6 士1)0C培养 1 8-2 4 h,5.3.5 结果观察 滴加 t o 写三氯化铁溶液数滴，自斜面培养物上流下，培养物呈深绿色者为阳性。5.4 蛋白陈水(靛基质试验用)5.4.1 成分 1 3GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1 多价陈2 0 g 氯化钠59 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.45.4.2 制法 按上述成分配制，分装小试管，1 2 1 灭菌 1 5 mi n，冷藏备用。5.4.3 靛基质试剂5.4.3.1 柯凡克试剂:将 5g 对二甲基氨基苯甲醛溶解于7 5 mL戊醇中，然后缓慢加人浓盐酸2 5 ml。5.4.3.2 欧一 波试剂:将 1 g对二甲基氨基苯甲醛溶解于 9 5 mL乙醇中，然后缓慢加人浓盐酸2 0 m l,.5.4.4 使用方法 用固体培养物或双糖铁或三糖铁培养物接种，(3 6 士1)0C1 8-2 4 h培养，必要时延长培养至3 d.5.4.5 结果观察 培养物中加人柯凡克试剂者，在两种溶液交界处呈红色为阳性;加人欧一 波试剂者，在两种溶液交界处呈玫瑰红色为阳性。对弱阳性者可先在培养物中加人少量二甲苯，充分混匀后再加人靛基质试剂。5.5 缓冲葡萄糖蛋白膝水(甲基红和 V P试验用)5.5.1 成分 磷酸氢二钾5 9 多价脉7 9 葡萄糖5 9 蒸馏水1 0 0 0 mL5.5.2 制法 混合上述成分，加热溶解后调 p H7.0，分装小试管，每管 1-2 mL,1 1 5 灭菌 2 0 mi n，冷却后冷藏备用。5.5.3 试剂5.5.3.1 甲 基红(M R)试剂:1 0 m g 甲 基红溶于3 0 m L 9 5%乙 醇中，然后加人2 0 m L 蒸馏水。5.5.3.2 V-P试剂:6%a-蔡酚一 乙醇溶液;4 0%氢氧化钾溶液。5.5.4 使用方法 挑取琼脂培养物或三糖铁或双糖铁培养物接种，(3 6 士1)培养1 8 2 4 h.5.5.5 结果观察55.5.1 甲基红试验:培养物加人甲基红试剂一滴，立即变为鲜红色为阳性，黄色为阴性。5.5.5.2 V-P 试验:培 养物中加人6%n-蔡酚一 乙醇溶液。.5 m L,4 0 Y.氢氧化钾溶液。.2 m L，数分钟内出现红色为阳性，不变色为阴性。5.6 尿素培养基5.6.1 成分 蛋白 陈2 0 g 。4%酚红溶液3 mL 氯化钠5g 尿素29 葡萄糖19 蒸馏水1 0 0 0 mL5.6.2 制法 除指示剂外，用水溶解上述成分，煮沸，用 1 mo l/L氢氧化钠溶液调节，然后加人指示剂，分装小试管，每管 1-2 m L,1 1 5 灭菌 1 5 mi n，冷却后冷藏备用。也可将除尿素外的其他成分 1 2 1 灭菌1 5 mi n 1 4G1 1/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1后加人过滤除菌的尿素溶液。5.6.3 使用方法 用固 体培养物或双糖铁或三糖铁培养物接种，(3 6 士ll0C 1 8-2 4 h 培养。5.6.4 结果观察 培养基由黄变红色为阳性。5.7 硝酸盐培养基5.7.1 成分 硝酸钾。.2 9 蛋 白陈59 蒸馏水1 0 0 0 m L p H7.45.7.2 制法 将上述成分溶解混匀，调p H至7.4，分装小试管，每管1 -2 m L,1 2 1 灭 菌1 5 m i n 备用。5.7.3 硝酸盐还原试剂5.7.3.1 甲液:将 0.8 g对氨基苯黄酸溶解于 1 0 0 m L 5 mo l/L乙酸溶液中5.7.3.2 乙液:将 0.5 g a-蔡胺溶解于 1 0 0 m L 5 mo l/L乙酸溶液中。5.7.4 使用方法 用琼脂培养物或双 糖铁或三糖铁培养物接种，(3 6 士1)培养 1 8-2 4 h o5.7.5 结果观察 培养物中先加人甲液数滴，再加人乙液数滴，出现红色为阳性。5.8 氧化酶试验5.8.1 试剂 1%盐酸二甲基对苯二胺水溶液，少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，一周内使用。5.8.2 试验方法 取滤纸条粘取菌落，加氧化酶试剂一滴,3 0 s 内呈现红色至紫红色反应为阳性，于2 mi n内不变色为阴性。注意:不能用接种针挑取菌落，只能用玻棒或竹签;对弱阳性者应同时用绿脓杆菌做阳性对照，用大肠埃希菌做阴性对照。5.9 过氧化氢酶试剂5.9.1 试剂 3%过氧化氢溶液，临用时配制。5.9.2 试验方法 用接种环挑取菌落于千净载玻片上，滴加 3%过氧化氢溶液适量，于 3 0 s内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。5.1 0 克氏双糖铁(K I)5.1 0.1 成分 蛋白 膝2 0 g 牛 肉膏39 酵母膏3 g 乳糖1 0 g 葡萄糖l g 氯化钠59 柠檬酸铁馁0.5 9 硫代硫酸钠。.59 1 5GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1 琼脂3g 酚红0.0 2 5 g 蒸馏水1 0 0 0 mL p H7.45.1 0.2 制法 棍合除琼脂和酚红的上述成分，加热溶解后校正 p H。加人琼脂，溶化后再加人。.2%酚红水溶液1 2.5 mL，摇匀，分装小试管，每管 3 mL,1 1 5 灭菌2 0 min，趁热放置成高层斜面，凝固后冷藏备用。5.1 0.3 使用方法 用接种针挑取菌落，先穿刺接种至高层底部，再沿穿刺线退出 在斜面上划线，(3 6 士1)培养 1 8-2 4 h,5.1 0.4 结果观察 斜面和高层均变黄者为分解葡萄糖和乳糖;高层破碎者为产气;高层变黄而斜面不变或变红者为分解葡萄糖，不分解乳糖;高层沿接种线变黑者为硫化氢阳性。5.1 1 三糖铁琼脂培养基(T S D5.1 1.1 成分 蛋白 陈1 5 g 示陈59 牛肉膏5.0 g 醉母膏3.0 g 乳糖3.0 g 蔗糖1 0 g 葡萄糖1 0 g 氯化钠1.0 g 硫酸亚铁5.0 g 硫代硫酸钠。.2 9 酚红溶液0.3 g 0.5%酚红溶液5 mL 琼脂1 2 g 蒸馏水1 0 0 0 m L p H7.45.1 1.2 制法 将上述成分(除琼脂和酚红外)混合，加热溶解后校正 p H，再加琼脂及酚红溶液，加热煮沸溶解。分装试管，每管4 mL，经 1 1 5 灭菌 2 0 min，立即置高层斜面，待凝固后经无菌试验备用。5.1 1.3 使用方法 用接种针挑取菌落，先穿刺接种至高层底部，再沿穿刺线退出在斜面上划线，(3 6 士1)培养1 8-2 4 h,5.1 1.4 结果观察 斜面和高层均变黄者为分解葡萄糖、蔗糖和乳糖;高层破碎者为产气;高层变黄而斜面不变或变红者为分解葡萄糖，不分解蔗糖和乳糖;高层沿接种线变黑者为硫化氢阳性。5.1 2 乙酸铅纸条5.1 2.1 制法 将滤纸剪成约。.5 c m x 1 0 c m的长 条，浸泡于3%乙酸铅水溶液中，以吸干水溶液为止。将该纸条置 3 7 培养箱中烘干，装人试管中，1 2 1 灭菌 1 5 mi n,1 6GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 15.1 2.2使用方法 悬空置于已接种的双糖铁或三糖铁或S I M培养管中，(3 6 士1)培养 1 8-2 4 h。注意:勿使纸条接触培养基，否则因纸条变湿而影响结果观察。5.1 2.3 结果观察 纸条变黑者为硫化氢阳性。5.1 3 S I M 培养基5.1 3.1 成分 胰蛋白陈2 0 g 多价陈0.6 9 硫酸铁按。.2 9 硫代硫酸钠0.2 9 琼脂3g 蒸馏水1 0 0 0 mL5.1 3.2 制法 混匀上述成分，加热溶解，调 p H7.2-7.4，分装小试管，每管 2-3 mL,1 2 1 灭菌 1 5 mi n，放成高层，凝固后冷藏备用。5.1 3.3 使用方法 用琼脂培养物穿刺接种，(3 6 士1)培养 1 8 -2 4 h e5.1 3.4 结果观察 沿接种线向周围生长者为动力阳性;培养基沿接种线变黑者为硫化氢阳性;滴加靛基质试剂，在交界处出现红色者为靛基质阳性(参见靛基质试验)。5.1 4 营养明胶5.1 4.1 成分 蛋 白陈59 牛 肉膏39 明胶1 2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 mL5.1 4.2 制法 混合上述成分，水浴加热溶解，校正p H 7.0-7.2，分装小试管，每管2-3 m L,1 2 1 灭菌1 5 m i n,放成高层，凝固后冷藏备用。5.1 4.3 使用方法 挑取琼脂培养物穿刺接种，(3 6 士1)培养 1 8 2 4 h e5.1 4.4 结果观察 培养物放 4 C 冰箱 Ih，未见凝固者为明胶液化试验阳性;凝固者为阴性。5.1 5 胆汁一 七叶昔培养基5.1 5.1 成分 胰蛋白 脉1.5 9 七叶昔0.1 g 琼脂29 胆汁2.5 mL 或胆盐0.3 g 柠檬酸铁。.2 g 蒸馏水1 0 0 mL 1 7GB/T 1 4 9 2 6.4 3-2 0 0 1 pH6.4-6.65.1 5.2 制法 上述成分加热溶解，调 p H至6.4 6.6，分装试管，1 2 1 灭菌 1 5 mi n，放成斜面备用。5.1 5.3 使用方法 用固体培养物沿斜面划线接种，(3 6 士I)培养1 8 -2 4 h,5.1 5.4 结果观察 培养基呈黑色者为阳性，不变色者为阴性5.1 6 西蒙氏柠檬酸盐培养基5.1 6.1 成分 氯化钠59 硫酸镁(Mg S 0,7 H,O)0.2 g 磷酸二氢按I g 磷酸氢二钾1 9 柠檬酸钠59 琼脂2 0 g 蒸馏水1 0 0 0 mL p H6.85.1 6.2 制法 先将盐类溶解于水中，再加人琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混匀后分装小试管，每管 2.3 mL,1 2 1 灭菌