低温反硝化聚磷菌脱氮除磷性能研究.pdf

基金项目：福建省教育厅项目（JAT210235，JAT200258）；厦门市科技补助项目（2022CXY0308）作者简介：林锦美，集美大学港口与海岸工程学院环境工程系讲师，硕士。DOI：10.14045/ki.15-1220.2023.05.001第38卷第5期内蒙古民族大学学报（自然科学版）Vol.38No.52023年09月Journal of Inner Mongolia Minzu UniversitySept.2023低温反硝化聚磷菌脱氮除磷性能研究林锦美1，2，武之杰1，陈锦芳1，段金明1，巫晶晶1（1.集美大学 港口与海岸工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021）摘要 经过对兰州市安宁污水处理厂冬季曝气池的活性污泥筛选、驯化分离获得反硝化聚磷菌；对其进行生理生化鉴定及核糖体的RNA的亚基（16S rDNA）基因序列测序，鉴定为荧光假单胞菌属Pseudomonas sp.以模拟废水的出水总氮（TN）、总磷（TP）、pH等为指标，考察反应温度、原水pH、摇床转速、不同碳氮比（C/N）等单因素对反硝化除磷菌脱氮除磷性能的影响。使用软件design-expert8.0.6.1将数据进行分析，获得二次响应面回归模型，并探究pH、温度、转速与TN去除率、TP去除率的交互作用。在最佳反应条件，即反应温度为16，反应时间为10 h，原水pH为7，摇床转速为140 rmin-1，C/N质量浓度比为12时，TN与TP的去除率分别为82.7%与88.1%，为今后城市废水处理提供支持。关键词 反硝化聚磷菌；脱氮除磷；低温中图分类号 X703文献标志码 A文章编号 1671-0185（2023）05-0385-07Study on Denitrification and Phosphorus Removal Performanceof Denitrification Phosphorus AccumulatingBacteria at Low TemperatureLIN Jinmei1，2，WU Zhijie1，CHEN Jinfang1，DUAN Jinming1，WU Jingjing1（1.College of Bioengineering，Jimei University，Xiamen 360121；2.Fujian Key Laboratory ofFood Microbiology and Enzyme Engineering，Xiamen 360121）Abstract：In this paper，the low temperature denitrifying phosphorus removal bacterium was screened，acclimated andenriched，and the biochemical identification and 16S rDNA gene sequence detection were carried out.The identificationresult was Pseudomonas sp.Using total nitrogen，total phosphorus and pH of simulated wastewater as indexes，the effectsof reaction temperature，reaction time，rotational speed，pH of raw water，C/N and other single factors on the denitrification and phosphorus removal performance of denitrifying phosphorus accumulating bacteria were discussed，andthe appropriate reaction conditions were determined.The data was analyzed using software design-expert 8.0.6.1 toobtain a secondary response surface regression model to explore the interaction of pH，temperature，and rotational speedwith TN and TP removal rates.The experimental results show that the optimum conditions for the treatment of highconcentration nitrogen and phosphorus simulated wastewater by denitrifying phosphorus accumulating bacteria areas follows：reaction temperature is 16，reaction time is 10 h，rotational speed is 140 rmin-1，pH of raw water is7，C/N is 12，etc.TN and TP with removal rates of 82.7%and 88.1%，respectively，providing technical support forthe treatment of municipal sewage with low temperature in winter.Key words：Denitrifying phosphate-accumulating organisms；Nitrogen and phosphorus removal；Low temperature传统的脱氮除磷工艺由于聚磷菌（Phosphate accumulating organisms，PAOs）与反硝化细菌对碳源存在内蒙古民族大学学报2023年竞争关系，导致氮磷不能高效去除1。而利用反硝化聚磷菌（Denitrifying phosphate accumulating organisms，DPAOs）进行的脱氮除磷工艺成为研究重点。反硝化除磷在缺氧条件下，可利用硝酸盐或亚硝酸盐作为最终电子受体分解胞内PHA，产生的能量可用于过量吸磷2。通过菌群代谢作用完成吸磷与反硝化的过程，提高脱氮除磷的效率，减少曝气量与污泥剩余量，实现能源节约与资源节约。脱氮除磷的工艺效果与反硝化聚磷菌的菌群特性有极大关系3。报道发现的大部分聚磷菌属于嗜温菌，其最适温度为30 左右。而在中国北方绝大多数地区冬季水温通常低于10，这种环境会抑制酶的活性，导致反硝化过程效率减缓。温度是脱氮除磷效果的重要影响因素4。笔者通过筛选低温反硝化聚磷菌株，探究单因素对菌株反硝化除磷性能的影响，获得最佳反应条件，以期为今后低温下城市废水处理提供参考。1材料与方法1.1实验材料1.1.1菌种和培养基菌种：从兰州市安宁污水处理厂冬季曝气池的活性污泥分离而得。富磷富氮培养基：三水乙酸钠3.23 gL-1、磷酸氢二钾25 mgL-1、氯化铵305.52 mgL-1、七水硫酸镁91.26 mgL-1、二水氯化钙25.68 mgL-1、硝酸钾300 mgL-1、氯化钠15 mgL-1、缓冲液8.5 mgL-1、pH为7.2。1.1.2模拟废水实验采用人工模拟生活污水，以葡萄糖为有机碳源，KH2PO4以及K2HPO4为磷源，NH4Cl为氮源，微量元素来源：CaCl2、FeSO47H2O和蛋白胨等。原水水质：TN为80 mgL-1、TP为10 mgL-1、pH为7。1.1.3仪器和试剂主要仪器：紫外可见分光光度计（UV751 GD）、摇床、智能生化培养箱、pH计（Model PHS-2C）、生物显微镜（B1-220）、PCR仪器（Real-time）、恒压恒流电泳仪（EPS301）、高速冷冻离心机（5417R）、凝胶成像仪（JS-080C）。主要试剂：细菌基因组快速提取试剂盒（盛生物技术有限公司），磷酸氢二钾、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、番红复染夜、香柏油、二甲苯等。1.2实验方法1.2.1生化鉴定根据文献 5-6，结合培养性状并参考假单胞菌菌种群分类系统对菌种进行生理生化特征鉴定。挑取的单菌落经划线纯化后进行革兰氏染色，同时，取纯化后的菌种接种于各种生化鉴定管（乙醇、丙酸盐、硝酸盐、葡萄糖、蔗糖、山梨醇等），28 恒温培养2448 h，观察并判定结果。1.2.216S rDNA的提取、PCR扩增、序列比对、进化树构建利用盛生物技术有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，对所获得培养物进行离心收集沉淀，用漂洗液PE洗涤离心后，并以此为模板设计16S rDNA基因的通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGCTA CCTTGTTACGACTT-3）进行PCR扩增。表1PCR反应体系Tab.1 PCR reaction system组分ddH2O10 PCR Buffer for KOD-Plus-Neo2 mM dNTPs点突变引物体积/L36524组分模板KOD-Plus-Neo（1U/L）Total体积/L2150386表2PCR扩增程序Tab.2 PCR amplification program步骤预变性变性退火延伸（从第2步到第4步循环30次）延伸温度/9498547272时间3 min1 min40 s1 min10 minPCR反应结束后，取5 L反应液进行琼脂糖凝胶电泳检测。将扩增出来的目的核酸片段送往上海立菲生物技术有限公司进行测序，并通过Blast工具和MEGA5.03软件进行比对分析并构建系统发育树。1.2.3脱氮除磷实验挑取纯化后的抗性菌株接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，16，120 rmin-1，过夜培养12 h。取1 mL菌液接种于150 mL灭菌的模拟废水中，按照实验要求进行脱氮除磷实验取样，经0.45 m的滤膜过滤，测定样品中TN、TP、pH值。每组实验重复3次，取平均值。1.3分析方法总氮的测定采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法（GB-11849-89），总磷采用钼酸铵分光光度法测定，pH采用pH计进行测定。2结果与分析2.1细菌生化鉴定结果对活性污泥进行分离纯化，将菌接种至生化管，28 恒温培养2448 h，进行细菌生化鉴定。实验结果显示，分离菌革兰氏染色呈阴性，硝酸盐还原试验反应阴性，可产生荧光；可分解蔗糖和木糖，能还原山梨醇、丙酸盐，能使蔗糖产生果聚糖，在4 生长，41 不可生长，符合荧光假单胞菌生理生化特征（表3）。表3 细菌生化鉴定结果Tab.3 Results of bacterial biochemical identification测定指标革兰氏染色荧光色素山梨醇4 丙酸盐检测结果-+测定指标反硝化蔗糖乙醇41 从蔗糖产生果聚糖检测结果-+-+注：+表示90%或90%以上的菌株为阳性；-表示所有的研究的菌株为阴性。2.2基于16S rDNA基因序列的系统发育分析通过 NCBI 网站的 Blast 程序，对测序结果进行在线比对，从中选取具有较高同源性的序列。在CLUSTALW2官网进行序列多重比对，同时，使用MEGA6.0软件构建系统进化树，结果见图1。Blsat结果显示，该序列与Pseudomonas sp.F330-7 16S ribosomal RNA gene（JQ995152）的进化关系最近。因而该菌株被初步鉴定为Pseudomonas sp属荧光假单胞菌属。2.3探究反硝化除磷菌生长过程中脱氮除磷性能在TN浓度为80 mgL-1、TP浓度为10 mgL-1、pH为7.0的模拟废水中，反应温度为15、转速为120 rmin-1的条件下，探究不同反应时间对脱氮除磷效果的影响，结果见图2。由图2可知，随着反应的进行，TN及TP值不断下降，细菌量不断增加，其去除率不断上升，10 h后菌株生长进入静止期，脱氮除磷性能趋于稳定，因此，后续实验反应时间均取10 h。第5期林锦美等：低温反硝化聚磷菌脱氮除磷性能研究387内蒙古民族大学学报2023年Pseudomonas sp.F 330-7（JQ995152）Pseudomonas sp.Pedobacter sp.（FM865642）Bacterium DC49（HQ178975）Pseudomonas sp.SE22#1a（AT263477）Pseudomonas sp.WE7#2b（AY263475）Pseudomonas hussainii（KF582607）Pseudomonas guangdongensis（JX274436）Pseudomonas oryzae（KF317694）Pseudomonas oryzae（NR133023）100908070605040302010024681012141618202224100806040200pHTNTN去除率TPTP去除率去除率/%时间/h含量/（mgL-1）、pH图1 16S菌株S-2的16S rDNA 基因系统发育树分析Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA genesequences of strain S-2图2 时间对脱氮除磷效果的影响Fig.2 Effect of time on denitrification andphosphorus removal2.4探究pH对脱氮除磷效果的影响在TN为79 mgL-1、TP为10 mgL-1、温度15、转速120 rmin-1、反应时间为10 h条件下，探究在不同pH条件下脱氮除磷效果的影响，结果见图3。进水的pH对TP的去除率影响不大，当pH处于酸性条件时，TN的含量随着pH的增加而下降，去除率不断上升，可能是pH过低时易破坏菌种的细胞结构，降低菌种代谢能力，从而影响正常的反硝化过程。当pH处于中性或弱碱性条件时，菌种生长繁殖较好，且脱氮除磷效果稳定。当pH处于碱性时，TP的去除率随pH增加而趋于平衡，说明可能是由于磷酸盐析出而造成TP的去除率变高的假象7。由此得出菌种的最适生长pH为8。2.5探究温度对脱氮除磷效果的影响在TN为79 mgL-1、TP为10 mgL-1、pH为7的模拟废水中，转速为120 rmin-1，反应时间10 h条件下，探究不同的反应温度对脱氮除磷实验影响，结果见图4。反应温度对TN去除率和TN去除量都有很大的影响，在4、8 时，菌株的生长和脱氮均受到明显抑制，可能与低温抑制反硝化酶的活性8有关；温度对反硝化除磷系统中污泥的TN和TP去除负荷具有显著的影响，当系统水温为16 时，系统污泥的TN和TP去除负荷较高，系统水温低于16 时，系统污泥的脱氮除磷效率显著降低。因此，后续反应温度取16。1008060402005678910100806040200去除率/%含量/（mgL-1）pHTNTPTP去除率TN去除率4812162024温度/100806040200100806040200TPTNTP去除率TN去除率去除率/%含量/（mgL-1）图3pH对脱氮除磷效果的影响Fig.3 Effect of pH on denitrification andphosphorus removal图4温度对脱氮除磷效果的影响Fig.4 Effect of temperature ondenitrification and phosphorus removal2.6探究摇床转速对脱氮除磷效果的影响在TN为79 mgL-1、TP为10 mgL-1、pH为7的模拟废水中，温度为16，反应时间为10 h条件下，探究不同的摇床转速对菌种的脱氮除磷效果的影响，结果见图5。当摇床转速小于140 rmin-1时，反应体系中溶解氧的含量较少；随着转速的增加，反应体系中溶解氧量不断增加，菌种与底物接触更充分，脱氮除磷效率提高9。当转速超过140 rmin-1时脱氮除磷效果下降，其原因可能是菌种间碰撞频率增加，影响菌种的正常生长，也可能是菌种的机械承受力水平不强，过高转速引起菌种自溶破裂，进而影响反硝化除磷效果10。后388续反应摇床转速取140 rmin-1。2.7探究不同的C/N质量浓度比对脱氮除磷效果的影响在TN为79 mgL-1、TP为10 mgL-1、pH为7的模拟废水中，摇床转速为140 rmin-1，反应时间为10 h，反应温度为16，探究不同的C/N质量浓度比对脱氮除磷效果的影响，结果见图6。菌株在低温环境下，不同的C/N质量浓度比条件都对脱氮除磷效果表现出较高程度处理能力，表明低温环境下仍具有着较大的应用潜能与开发条件。菌株在C/N质量浓度比为12时达到最佳脱氮效率，这一结果与已有的研究结果类似11-12。1008060402002060100140180220转速/（rmin-1）含量/（mgL-1）去除率/%TPTNTP去除率TN去除率100806040200含量/（mgL-1）去除率/%1008060402001008060402002468101214C/NTPTNTP去除率TN去除率图5转速对脱氮除磷效果的影响Fig.5 Effect of rotational speed on denitrificationand phosphorus removal图6不同的C/N质量浓度比对脱氮除磷效果的影响Fig.6 Effect of C/N on denitrification andphosphorus removal2.8响应面曲面法对反硝化除磷培养条件的优化为了寻找到反应的最优条件，选取与菌株反硝化除磷作用较为相关的3个因素：pH（A）、温度（B）、转速（C），进行三因素三水平实验，方案见表4。表4实验设计方案及实验结果Tab.4 Experimental design scheme and experimental results实验数1234567891011121314151617pH-10-10111-1001000-100温度/1-100-10000011-11-100转速/（rmin-1）01-1001-11000-1-11000TN去除率/%37.662.930.184.766.972.844.659.088.483.669.571.572.265.433.487.283.3TP去除率/%36.563.536.587.669.670.548.658.389.488.375.270.673.567.535.685.389.6使用软件design-expert8.0.6.1将数据进行分析处理并进行模拟，最后分别得到了TN与TP的去除率与以上3个因素的编码值的函数关系，结果如下：R1=85.44+11.71A+1.15B+10.39C-0.40AB-0.18AC+0.95BC-30.16A2-3.43B2-3.66C2R2=88.04+12.13A+0.56B+9.46C+1.18AB+0.025AC+0.95BC-30.19A2-3.62B2-4.37C2其中，R1代表TN去除率，R2代表TP去除率，A、B、C分别代表了pH、温度、转速的编码值。TN去除率、TP去除率的方差分析见表5、表6。从表5、表6可以看出，Model显著性检测P0.05，该第5期林锦美等：低温反硝化聚磷菌脱氮除磷性能研究389内蒙古民族大学学报2023年模型具有统计学意义，并且适用于本研究。其中，变量A显著，变量A2极其显著，其余变量不显著。使用软件design-expert8.0.6.1将数据进行分析，获得二次响应面回归模型，各因素与TN去除率、TP去除率的交互作用见图7、图8。由图7、图8可知，TN去除率、TP去除率会随着pH（A）、温度（B）、转速（C）先增加后减少的趋势，A、B，A、C交互作用响应面较为陡峭，等高线椭圆程度较为明显，表明pH与温度间、pH与转速间的交互作用对于TN与TP的去除率影响显著。将R1、R2的目标值设为maximize，R1的lower设为30.1，upper改为88.4；R2的lower设为35.6，upper设为89.6，最后得出最优处理条件见表7。由表7获得反硝化除磷的最佳处理条件是pH为8，温度为16，转速为140 rmin-1。表5以TN去除率为响应值的方差分析Tab.5 Variance analysis with TN removal rate as response value来源ModelA-pHB-TC-RevABACBCA2B2C2剩余值失拟误差纯误差总离差平方和4 855.751 097.469.24217.360.640.122.562 627.90311.95328.48852.58832.2120.375 708.33自由度911111111173416均方差539.531 097.469.24217.360.640.122.562627.90311.95328.48121.80277.405.09F值4.439.010.081.780.010.000.0221.582.562.7054.47P值概率F0.031 30.019 90.790 90.223 40.944 20.975 60.888 80.002 40.153 50.144 50.001 1显著显著表6以TP去除率为响应值的方差分析Tab.6 Variance analysis with TP removal rate as response value来源ModelA-pHB-TC-RevABACBCA2B2C2剩余值失拟误差纯误差总离差平方和4 925.371 176.137.22117.055.520.0011.902 539.25360.85421.68711.80699.7412.055 637.16自由度911111111173416均方差547.261 176.137.22117.055.520.0011.902 539.25360.85421.68101.69233.253.01F值5.3811.570.071.150.050.000.1224.973.554.1577.41P值概率F0.018 60.011 40.797 60.318 90.822 40.996 20.742 30.001 60.101 60.081 10.000 5显著显著（a）TN去除率/%90807060504030252015105678910pH温度/（b）TP 去除率/%90807060504030252015105678910pH温度/图7pH与温度间交互作用对污染物去除率的响应面和等高线Fig.7 Response surface and contour line of interaction between pH and temperature on removal rate390（a）TN去除率/%908070605040302201651105505678910pH转速/（rmin-1）（b）90807060504030TP去除率/%转速/（rmin-1）pH220165110550 5678910图8pH与转速间交互作用对污染物去除率的响应面和等高线Fig.8 Response surface and contour line of interaction between pH and revolving speed on removal rate表7 处理最优条件组合以及其预测降解率Tab.7 Optimum culture condition combination and its predicted degradation rate序号1pH8.12温度/15.90转速/（rmin-1）138.46TN去除率/%87.592 0TP去除率/%89.934 8可信度0.8613结论（1）污水处理厂冬季曝气池的活性污泥中筛选出的低温异氧反硝化菌，经16S rDNA基因序列同源性分析，该菌株为荧光假单胞。（2）通过响应面分析可得，pH与温度、pH与转速的交互作用对于TN与TP的去除率影响显著。实验所筛选出的培养优化组合在反应温度为16，反应时间为10 h，转速为140 rmin-1，原水pH为8，C/N质量浓度比为12时，反硝化除磷菌TP与TN的去除率分别为82.7%与88.1%，具有较好的脱氮除磷效果。参考文献1 黄靓，郭海燕，刘小芳.反硝化聚磷菌的培养及其脱氮除磷特性 J.化工环保，2019，39（2）：158-162.2 郑春霞，王侧容，张漫漫，等.反硝化聚磷菌及其脱氮除磷机理研究进展 J.生物工程学报，2023，39（3）：1009-1025.3 ZHENG L，WU X，DING A，et al.Phosphorus release and uptake of a denitrifying 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