低温诱导芹菜种子次生休眠及其调控机制.pdf

南京农业大学学报():/.:./.收稿日期:基金项目:上海市科委农业领域项目()国家自然科学青年基金项目()年上海市绿叶菜产业技术体系建设长征试验站上海市农业科学院卓越团队农科卓()作者简介:李涵硕士研究生通信作者:徐志刚教授主要从事植物光环境生理研究:.朱为民研究员主要从事蔬菜栽培与遗传育种研究:.李涵阎君吴珏等.低温诱导芹菜种子次生休眠及其调控机制.南京农业大学学报():.():.低温诱导芹菜种子次生休眠及其调控机制李涵阎君吴珏黄志午朱明芬范林华朱为民徐志刚(.南京农业大学农学院江苏 南京.上海农业科学院设施园艺研究所上海.上海市奉贤区农业技术推广中心上海.南京农业大学园艺学院江苏 南京)摘要:目目的的 本文旨在探究 低温处理对芹菜种子萌发的抑制作用及其调控机制 方方法法 以上海黄心芹种子为试验材料设置 和 处理探究其萌发情况、赤霉素()和脱落酸()含量及代谢通路中关键基因表达量动态变化及淀粉及可溶性糖含量的动态变化 结结果果 低温处理显著抑制了芹菜种子萌发率、种子出苗率、相对吸水量和种胚的生长 处理则能快速促进种子萌发将 处理 后的种子转入 后(处理)种子又能快速恢复萌发活力说明 低温并没有对种子造成不可逆伤害种子活力染色的结果也说明低温并没有对种胚结构造成伤害 低温还显著抑制了种子萌发期间 的合成相关的代谢及下游基因也被明显抑制表达而 处理则显著促进 的合成并且 基因在 处理以及 处理中的高表达说明其可能对 的合成发挥关键作用 处理中 含量呈波动变化但/整体呈下降趋势 降解基因 的表达量与 处理种子萌发中后期的 含量有明显的负相关趋势 另外 还明显抑制了芹菜种子的糖代谢能力 处理的种子在萌发期的淀粉含量明显高于 处理但可溶性糖含量明显低于 处理 结结论论 低温诱导芹菜种子发生了次生休眠/可能是芹菜种子响应环境温度的重要信号并且 和 是潜在的应对低温的关键基因关键词:芹菜种子低温初生休眠次生休眠赤霉素脱落酸中图分类号:.文献标志码:文章编号:()(.):.()().()./.南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 ./.:种子是植物重要的传播单位在自然条件下脱离母体后种子的顺利萌发对植物种群的繁衍具有重要意义 植物进化出很多策略调节萌发过程其中种子休眠是植物应对环境变化并确保种子能够在适宜环境萌发重要手段 休眠是植物生长发育过程中的一个暂停现象广义上的休眠是指具有正常活力的完整种子在适宜的环境中不能萌发的现象 但经过多年对不同物种的研究研究者对植物种子的休眠类型进行了不同的分类:和 将种子休眠分为种子成熟就获得的初生休眠和由环境引起的次生休眠 类 等和 等将种子的休眠类型进行了扩展增加了新的休眠类型包括生理休眠、形态休眠、形态生理休眠、物理休眠和组合休眠尽管种子休眠在农业生产中具有一定的意义但休眠造成的萌发延迟对实际生产产生了极大的麻烦在众多环境因子中温度被认为是影响种子休眠和萌发的最重要的环境因素之一 适度的低温处理已被证实能解除拟南芥()、丁香()、羊草()等多种植物的初生休眠并刺激萌发对拟南芥的广泛研究也证明适度的低温能够促进赤霉素()合成并加速脱落酸()降解 越来越多的证据表明/是温度调控种子萌发的关键信号近年来极端天气出现的概率增加作物种子在田间播种后遭遇低于萌发温度的低温易诱发次生休眠不仅减少出苗率更会影响产量芹菜(.)是广泛种植的蔬菜作物性喜凉在国内外栽培广泛 芹菜种子是典型的形态休眠类型即种子成熟时胚未发育成熟胚占整个种子体积小萌发时易受环境影响 在本课题组的前期研究中发现 低温会明显抑制芹菜种子萌发而 的亚低温则能明显促进种子萌发 为了解析 低温对芹菜种子萌发的抑制机制本研究分别对芹菜种子进行 和 处理并从 和 的含量合成、降解和信号传导基因的动态变化等方面展开研究以期揭示芹菜种子应对低温的生理响应机制为后续抗寒机制研究提供参考 材料与方法.萌发试验供试品种为上海黄心芹选取外形饱满均匀无病变的种子置于培养皿中并加入适量蒸馏水随后将培养皿置于 和 培养箱中每日记录萌发种子数量 处理进行到 时将种子转移至 每日记录萌发种子数量并将其命名为 所有萌发试验共 个重复每个重复 粒种子称取.干种子用纱布包裹后放于烧杯并加入蒸馏水没过其表面随后将烧杯放于 和 培养箱中前 每隔 将种子取出擦干水分并称重 后每隔 称重 每个处理 次重复按照公式计算相对吸水量:相对吸水量()/式中:为初始干种子的质量为某个检测时间点称取的种子质量提前在穴盘中装满有机基质将在 和 分别浸种 的种子点播于穴孔中并将穴盘置于 和 培养箱中观察出苗率共观察 每个重复 粒种子共重复 次用刀片将不同萌发时间的种子从中间剖开并将半粒种子置于显微镜下拍照利用 统计照片中胚与整个种子的比例(胚率)每个时间每个处理共选择 个种子进行检测.提取及 使用 提取芹菜种子 处理分别在、时取样 处理分别在、时取样分别在转入 后的 和 取样即 处理的 和 由于转入 后 时已经有种子萌发因此在取样时仅选取未萌发的种子反转录及 反应均使用反转录试剂盒(日本)反应体系参照说明书 引物参考 第 期李涵等:低温诱导芹菜种子次生休眠及其调控机制 等的研究并使用 (:/./)重新设计以 为内参基因具体引物序列见表 表 引物序列 基因名称 基因编号 引物序列()/.赤霉素及脱落酸含量测定使用上海酶联生物的 试剂盒测定赤霉素及脱落酸含量 取样时间为、取样时间为、分别在转入 后的 和 取样具体步骤参照说明书进行重复 次.种子活力、淀粉及可溶性糖含量测定种子活力染色采用(三苯基氯化四氮唑)法将红四氮唑配制成.的溶液将种胚完整取出后浸入 溶液中染色 并拍照 采用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒测定淀粉及可溶性糖含量 取样时间为、取样时间为、具体步骤参照说明书重复 次.数据处理利用 软件整理数据采用 软件绘图借助 软件利用单因素方差分析()选用 检验和 检验对不同处理进行差异显著性分析 结果与分析.不同温度处理对芹菜种子萌发的影响由图 可见:处理显著抑制芹菜种子的萌发能力在长达 的时间里没有种子萌发 处理可以显著促进种子萌发最终萌发率达到 萌发率和发芽指数显著高于 处理 对不同温度处理的芹菜种子出苗率分析后发现 下种子出苗率可达 没有种子出苗(图)对 和 处理种子的相对吸水量测定后发现 处理种子的相对吸水量呈明显的“”曲线前 种子的吸水速度较快为吸涨吸水期 至 吸水速度放缓为吸水滞缓期 种子开始萌发胚根突破种皮后需水量增加进入主动吸水期 处理的种子在吸水饱和后即进入吸水滞缓期并且相对吸水量始终小于 处理的种子(图、)为了观察不同温度下芹菜种子胚的生长速度对芹菜种子的胚率进行了测定结果发现 处理下芹菜种子的胚生长迅速 时胚率已经达到.但 处理种子的胚生长异常缓慢尽管 时的胚率(.)与 处理 的没有显著差异但仍然小于 处理(图)由于我们观察到 处理种子在 时的胚率与 没有显著差异同时也为了探究 低温是否对芹菜种子产生了不可逆的影响将 处理 的种子转移至 中()结果发现在转入 的 (的 )种子便开始萌发在 时萌发率达到了.(图、)综上所述我们认为 低温使芹菜种子发生了次生休眠这使得在长达 的时间芹菜种子无法完成萌发过程并且 低温也抑制了芹菜种子的吸水速度和胚生长南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 芹菜种子经不同温度处理后的表型特征 .为芹菜种子经 处理后、的侧切图.芹菜种子经 、和 处理后的每日萌发曲线、.芹菜种子经、和 处理后的萌发率和发芽指数.芹菜种子经 、处理后的出苗率.芹菜种子在 、下的动态相对吸水量.芹菜种子经 、处理后的胚率动态变化.:无显著差异 .不同温度处理后芹菜种子赤霉素含量及相关基因表达情况对不同温度处理下芹菜种子的赤霉素()含量动态变化进行测定后发现 处理种子的 含量在 持续增加而 处理种子在 有小幅增加后又持续降低 又有所增加 另外对经 处理 后转入 的种子()的 含量进行测定后发现转入 的种子 含量与同时期 处理的种子相比明显增加(图)对 代谢通路中的关键基因表达情况进行测定后(图)发现 处理种子的 合成基因(、)以及 降解基因()表达量整体均呈下调趋势处理的种子与 处理种子没有明显差异 个基因始终表达量很低而 处理种子的、以及 在萌发前 均表现为先下调再上调但 的表达却明显上调并且其表达量也明显高于同时期 处理种子 在 处理后同样出现上调这说明 适温可能主要是通过调控 的表达来促进 合成 是 的受体蛋白其编码基因在 始终低表达 下 先下调再上调但 处理却没有增加其表达(图)是 下游的转录因子对种子萌发起抑制作用 处理后其表达量在 明显下降随后始终低表达在 其表达量多有起伏与 相比处理 的 先明显下调随后又上调(图)第 期李涵等:低温诱导芹菜种子次生休眠及其调控机制图 不同温度处理下芹菜种子赤霉素含量()及代谢相关基因表达量()()().不同温度处理后芹菜种子脱落酸含量及相关基因表达情况对不同温度处理种子脱落酸()含量的动态变化进行测定后发现尽管 能有效促进种子萌发但 含量在 一直增加 处理种子在 时的 含量变化趋势与 非常相似但随后 含量下降 含量最低随后又一定程度增加处理种子的 含量明显低于同时期的 处理(图)对 代谢及信号传导基因的表达情况进行测定后发现 处理种子的 合成基因(、)降解基因()以及下游转录因子(和)均在萌发前 下调表达随后又在 时上调表达 处理种子的各个基因除 外均在 时明显下调另外 基因在 后的表达趋势与 含量变化趋势较为相似 的表达量在、和 时一直上调表达可能对萌发后期的 合成起促进作用 下游的 和 表达量则始终维持较低水平(图、)另外负责 降解的 表达量在种子萌发中后期与 处理种子的 含量基本呈相反的趋势例如其在 时表达量达到最高而 含量在 时最低 处理的种子 含量相比 处理明显降低处理的 表达相比同时期的 处理显著上调而 表达又显著下调处理其他基因表达趋势与 处理没有明显差异对不同温度处理下种子的/比值进行分析后发现 处理和 处理种子的/均在萌发时呈上升趋势 处理 的 含量增加但/却明显下降尽管 处理 时/有小幅增加但随后又呈下降趋势.不同温度处理对芹菜种子活力及糖代谢的影响对 处理 的种子和 处理 的种子进行种子活力染色结果(图)发现在经过 的染色后 和 处理种子的种胚均能被染成红色这也进一步说明 处理尽管降低了种子的萌发活力但却未对种子结构造成不可逆伤害对种子萌发期间的可溶性糖和淀粉含量进行测定结果(图、)发现 处理明显促进淀粉分解和可溶性糖含量增加而 低温处理后淀粉的分解速度和可溶性糖含量增加却异常缓慢这说明 低温明显抑制芹菜种子的糖代谢能力进而影响糖分分解为胚生长提供能量的过程南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 不同温度处理下芹菜种子脱落酸含量及代谢相关基因表达量 .不同温度处理芹菜种子/的动态变化.不同温度处理芹菜种子 含量的动态变化.不同温度处理芹菜种子 代谢及信号传导相关基因表达量的动态变化./.图 不同温度处理对芹菜种子活力及糖代谢的影响 .处理 和 处理 时种胚的活力染色 、.不同温度处理后芹菜种子可溶性糖和淀粉含量的动态变化 .第 期李涵等:低温诱导芹菜种子次生休眠及其调控机制 讨论初生休眠的产生与解除机制一直是种子科学研究的重点在以拟南芥为代表的模式植物中已经有比较深入的研究 然而关于种子次生休眠的研究却相当有限 尽管温度是影响种子季节性休眠与解除的关键环境信号但当前的研究大多关注由高温引起的“热休眠”对低温引起的次生休眠研究相对较少因此本研究以前期研究为基础选择能有效促进芹菜种子萌发的 亚低温和能明显抑制种子萌发的 低温为试验条件探究低温对芹菜种子次生休眠的产生和作用机制本研究发现 处理种子的萌发率和发芽指数显著高于 处理在 内 处理没有种子萌发并且 低温处理的芹菜种子出苗率为 这说明在实际生产中芹菜播种后遭遇低温天气极有可能对最终产量产生重大影响 本研究也发现低温会明显抑制芹菜种子的吸水速度导致主动吸水期始终没有出现这与陈昊等关于花生(.)种子的研究结果类似 另外低温还抑制了芹菜种子胚的生长 处理 的种子胚率为.尽管 处理种子 时胚率与 处理 没有显著差异但仍然低于 处理并且 处理 时胚率与 同样没有显著差异这说明在低温条件下种胚的生长速度愈加缓慢目前种子休眠的激素调控理论是被普遍接受的 等发现 低温会抑制不耐低温水稻品种的 合成多个 合成基因的表达也被抑制 等发现拟南芥在 中能有效解除初生休眠并且 低温能明显促进 合成基因、和 的表达但 降解基因 的表达被 低温明显抑制 但在本研究中却有不同的结果与 低温相比 亚低温能够明显促进种子萌发期和 处理中 的合成并且 的表达在 和 处理中均被上调此外 的表达被 处理抑制而 低温明显抑制了 的合成同时 的合成、降解以及下游受体和信号基因的表达也被 抑制 据此推测 基因可能对芹菜种子在适宜环境中的 合成发挥关键作用而低温对 的代谢及信号通路均有抑制阻碍 发挥作用在拟南芥中 低温会诱导 合成并且抑制 分解基因 的表达 低温可以促进甜菜(.)种子 的降解 的多个合成及降解基因分别被抑制与促进表达本研究发现在低温环境下芹菜种子萌发的不同时期可能有不同的代谢基因发挥主要作用 低温环境下 含量在前 持续增加但本研究检测的相关 合成基因却始终维持低表达相反 降解基因却在萌发早期有较高表达 类似情况在 处理中也有发现尽管 处理环境下芹菜种子 含量在前 不断增加但相关 合成基因却同样表达量较低而 表达量却在上调在 处理芹菜种子萌发的中后期则发现 降解基因 表达量与 含量有明显的负相关趋势而 合成基因 和 则与 含量有明显正相关趋势 处理中 含量相比 处理明显下降 的表达明显上调 因此与 相关代谢基因的功能对不同温度环境的响应还有待进一步研究尽管 处理种子在萌发期间 含量不断增加/在萌发期同样持续增加但 处理种子的/整体呈下降趋势 等提出 和 通过合成和分解代谢的动态平衡来影响/这能够改变种子对周围环境的敏感性进而调节萌发过程 目前拟南芥、大豆、阿拉伯岩芥等物种的研究均指出/(即 与 的动态变化)才是影响种子萌发的关键信号 另外处理中的/相比同时间的 处理种子也明显增加因此认为相比于 与 绝对含量/可能才是芹菜种子响应环境温度并调节萌发的关键信号研究提出赤霉素和脱落酸协同调控种子萌发的机制可能与它们共同调控种子中 淀粉酶基因有关 可溶性糖是植物体内重要的渗透调节物质和能量代谢物质种子萌发时淀粉被 淀粉酶在内的多种酶分解为小分子糖类参与氧化供能 可以与 淀粉酶合成基因上游启动子的 应答元件结合促进其转录而 作用则相反 本研究发现 亚低温促进了芹菜种子赤霉素的合成并且在种子萌发过程中淀粉含量显著下降而可溶性糖含量显著上升但 低温则明显抑制了淀粉分解因此推测 可能参与了芹菜种子中的糖代谢过程其机制还有待进一步研究综上所述与 相比 明显抑制了种子的萌发率、相对吸水量与出苗率可能会对实际生产过程产生重大影响 低温处理抑制了 与 之间的动态平衡以及信号通路中关键基因的表达并南 京 农 业 大 学 学 报第 卷且芹菜种子的糖代谢供能也明显被抑制这使得种胚的生长异常缓慢无法完成萌发过程但 低温并没有对胚结构造成不可逆伤害 处理促进了 和 的合成但/在萌发期的增加可能才是芹菜种子响应温度并调节萌发的关键信号并且 处理还促进了可溶性糖含量的增加增强了萌发期间的糖代谢能力 因此本研究认为 低温诱导芹菜种子发生了次生休眠但在低温早期 的代谢调控过程还有待进一步研究参考文献:.:.():.李超张凌宇路加等.外源脱落酸对鳗草种子休眠的延长作用.中国海洋大学学报(自然科学版)():.()():().王永飞王鸣王得元等.种子休眠机制的研究进展.种子():.():().():.():.():.():.:.:.():.:.():.():.李鲜花张颖罗彩云.低温层积处理对北京丁香种子萌发的影响.山西农业科学():.():().():.:.():.():.李涵朱为民阎君等.不同红蓝光比例对芹菜幼苗生长和物质分配的影响.北方园艺():.():().(.).():.陈昊徐日荣陈湘瑜等.花生种子萌发吸胀阶段冷害抗性的鉴定及耐冷种质的筛选.植物遗传资源学报():.():().:().():.:.():.:.():./(/).():.:.():.():./:.():.责任编辑:范雪梅