DB32∕T 3209-2017 脱毒甘薯种薯(苗)SPCSV、SPVG、SPLCV检测技术规程.pdf

ICS 65.020.20 B23 DB32 江苏省地方标准 DB 32/ T 32092017 脱毒甘薯种薯(苗)SPCSV、SPVG、SPLCV 检测技术规程 Technical refulation for SPCSV、SPVG、SPLCV detection of virus-free seed (seedling) sweetpotatoes 2017 - 05 - 05 发布 2017 - 06 - 05 实施 江苏省质量技术监督局 发 布 DB32/ T 32092017 I 前 言 本标准按GB/T 1.12009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写编制。 本标准由江苏徐州甘薯研究中心提出。 本标准主要起草单位：江苏徐州甘薯研究中心。 本标准主要起草人：谢逸萍、孙厚俊、张梅、杨冬静、张成玲、赵永强、徐振，谢睿寰，孙扬。 DB32/ T 32092017 1 脱毒甘薯种薯(苗)病毒检测技术规程 1 范围 本标准规定了脱毒甘薯种薯(苗) SPCSV、SPVG、SPLCV 检测的术语和定义、抽样方法、检测方法和判定指标。 本标准适用于脱毒甘薯种薯(苗) SPCSV、SPVG、SPLCV的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 4406 种薯 NY/T 1200 甘薯脱毒种薯 NY/T 402-2000 脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用本标准。 3.1 脱毒组培苗 virus-free tissue culture seedling 应用茎尖组织培养技术获得，经检测，确认不含特定病毒的甘薯再生组培苗。 3.2 扩繁苗 propagation seedling 将脱毒组培苗切段快速繁殖获得的试管苗。 3.3 脱毒种薯(苗) virus-free seed tuber or seedling 从脱毒苗繁殖开始，经逐代繁殖体系获得的不携带特定病毒的种薯（苗）。分原原种、原种、良种三个级别。 3.4 原原种 pre-elite 用脱毒试管苗在60目防虫网室、温室条件下生产的符合质量标准的种薯(苗)。 DB32/ T 32092017 2 3.5 原种 elite 用原原种作种薯，在防虫网室、温室隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯(苗)。 3.6 良种 excellent seed or seedling 用原种作种薯，在隔离条件下生产出的符合质量标准的种薯(苗)。 3.7 病毒病株允许率 Maximum virus-infected plant percentage allowed 指各级甘薯种薯(苗)繁殖田中病毒病株的允许比率。 4 检测病毒种类 甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV） 甘薯G病毒（Sweet potato virus G，SPVG） 甘薯卷叶病毒（Sweet potato leaf curl virus，SPLCV） 5 抽样 5.1 组培苗抽样 5.1.1 脱毒组培苗 每株必须检测。 5.1.2 扩繁苗 随机抽取l%2%检测。 5.2 田间抽样 5.2.1 原原种田和原种田抽样 定植后30d、60d、收获前2周，采用5点随机取样法，抽样数量为0.1 hm2以下200株；0.11 hm21 hm2 500株；超出1 hm2面积，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。每株取上、中、下部叶片和叶柄1g5 g，46保湿存放，24 h内检测。 5.2.2 良种田抽样 定植后30d、收获前两周，采用随机取样法，0.1 hm2以下检验5点，每点40株；0.11 hm21 hm2检验5点，每点100株；1.1 hm25 hm2检验10点，每点100株；超出5 hm2面积，划出另一检验区，按本规程规定的面积取样。取样方法及样品保存同5.2.1。 5.3 种薯(苗)抽样 DB32/ T 32092017 3 种薯送检数量应不低于100kg,种苗送检数量应不低于100株。 6 检测方法 6.1 溶液配制 所用化学试剂为分析纯级规格，用水为灭菌蒸馏水。 6.1.1 三羟甲基氨基甲烷溶液(TBS)(pH=7.5 ) 三羟甲基氨基甲烷（Tris）4.84g，氯化钠（NaCl）58.44g，溶于1990ml蒸馏水中，用18.5盐酸（HCl ）调pH至7.5，定容至2000ml。 6.1.2 洗涤缓冲液(T-TBS) 1.0ml 吐温-20(Tween-20)溶于2000mlTBS中。 6.1.3 提取缓冲液 亚硫酸钠（Na2SO3)1.0g，溶于 TBS 中，定容至 500ml。 6.1.4 封闭缓冲液(现用现配) 2脱脂奶粉6.0g，先将脱脂奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至300ml，混匀。加6ml曲拉通（Triton ）X-100充分混匀。 6.1.5 抗体稀释缓冲液 2脱脂奶粉6.0g，先将脱脂奶粉溶解于少量TBS中，再用TBS定容至300ml，混匀。 6.1.6 底物缓冲液(pH=9.5) 三羟甲基氨基甲烷（Tris）6.05g，氯化钠(NaCl) 2.92g，氯化镁(MgCl26H2O) 0.51g，溶于 450 ml蒸馏水中，用浓盐酸调pH值至9.5，定容至500ml, 6.1.7 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）储备液 氯化硝基四氮唑蓝（NBT）0.04g溶于1.2 ml 70%N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，-20避光保存备用。 6.1.8 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐（BCIP）储备液 0.02g 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)溶于1.2 ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，-20避光保存备用。 6.1.9 底物溶液(现用现配) 将75l NBT储备液溶于25ml底物缓冲液中，再逐滴加入75l BCIP储备液，边加边振摇混匀。 6.2 样品制备 从田间取回待测脱毒甘薯样品（取叶片加叶柄）放入事先编号封口袋，用直径15mm打孔器取叶片和叶柄的结合部，需隔在塑料袋外取，只留叶片和叶柄的结合部，其余除去；加1ml提取缓冲液，充分研DB32/ T 32092017 4 磨。4静置30 min40min，或室温放置20 min30 min，使植物汁液充分提取；取澄清汁液点样。样品为块根时催芽处理后取幼芽、叶制样。 6.3 操作步骤 6.3.1 点样 将一张干燥的滤纸放在实验台上，将硝酸纤维素膜放在上面，避免气泡产生；b、用移液枪吸取塑料袋中提取液上清部分15l20l，点在膜上方格正中，枪头不可触碰到膜，一个样品用一个枪头，在每张膜的最后设置阳性、 阴性和空白对照， 点样完成将膜转到一张干燥的滤纸上， 干燥15 min20 min，在继续实验前可以用两张滤纸夹着膜保存。 点样过程中一直戴手套和用镊子接触膜， 手指印可能造成假阳性结果。 6.3.2 封闭 将干燥后的膜浸泡在封闭缓冲液中，室温下摇床振荡(50rpm/min)1h。 6.3.3 孵育第一抗体 将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的抗血清中，室温下摇床振荡(50rpm/min)过夜。 6.3.4 洗涤 用洗涤缓冲液洗膜3次，每次摇床振荡(100 rpm/min)3 min。 6.3.5 孵育第二抗体 将膜置于用抗体缓冲液稀释至工作浓度的酶标抗体中，室温下摇床振荡(50 rpm/min)1 h。 6.3.6 洗涤 洗涤4次，方法同6.3.4。 6.3.7 显色 将膜置于NBT/BCIP底物溶液中，室温下摇床振荡(50 rpm/min)孵育30 min。 6.3.8 终止反应 弃去底物溶液并用蒸馏水洗膜3次，每次摇床振荡(100 rpm/min)3 min。 6.3.9 阳性判断 晾干后观察颜色反应，出现蓝紫色颜色反应的样品为阳性。 7 判定指标 凡硝酸纤维素膜酶联免疫吸附检测呈阳性者为带毒薯(苗)。 原原种：病毒病株允许率是 0。 原种：病毒病株允许率2.0%。 良种：病毒病株允许率10%。 _