课题3血红蛋白的提取和分离教学设计教案.docx

   教学准备
1.   教学目标
1、尝试从血液中提取与别离血红蛋白
2、了解色谱法、电泳法等别离生物大分子的根本原理
2.   教学重点/难点
教学重点：
凝胶色谱法的原理与方法
教学难点：
样品的预处理；色谱柱填料的处理与色谱柱的装填
3.   教学用具
教学课件
4.   标签
   教学过程
〔一〕引入新课
蛋白质的知识回忆：
含量：占细胞干重的50％以上，是细胞中含量最多的有机化合物。
2、组成元素：C、H、O、N
3、根本单位：氨基酸
4、分子构造：
氨基酸—多肽—蛋白质
 肽键：—CO—NH—
5、相对分子质量：高分子化合物
蛋白质是生命活动的主要承当者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识与理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进展研究。怎样提取蛋白质呢？
〔二〕蛋白质分子的差异性
1．根底知识
蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质与多少、溶解度、吸附性质、亲与力等千差万别，由此提取与别离各种蛋白质。
1．1凝胶色谱法〔分配色谱法〕：
〔1〕原理：〔见课件图〕分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。
〔2〕凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。
〔3〕别离过程：
混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子
＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。
1．2缓冲溶液
〔1〕原理：由弱酸与相应的强碱弱酸盐组成〔如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等〕，调节酸与盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。
〔2〕缓冲液作用：抵抗外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。
1．3凝胶电泳法：
〔1〕原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状与大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向与运动速度不同。
［思考］阅读投影补充材料后，填写下表：
〔2〕别离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。
〔3〕别离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；参加带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物〞，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
例：聚丙烯酰胺凝胶电泳
1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠〔SDS〕—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺与交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂与催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状构造的凝胶。
2.原理： 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。〔SDS的作用〕为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中参加SDS。
3. SDS作用机理:
SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
〔三〕、血红蛋白的提取与别离实验设计
蛋白质的提取与别离一般分为哪些根本步骤？
样品处理、粗别离、纯化、纯度鉴定。
思考：是否所有种类的蛋白质的提取与别离都是这样的？为什么？
不是。因为蛋白质的来源与性质不同，别离方法差异很大。
选择实验材料
〔1〕你认为鸟类血液与哺乳动物血液中，最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？
哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核，血红蛋白含量高。
〔2〕请阅读投影资料，认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考答复以下问题：
血液由血浆与血细胞两局部组成。
血细胞中红细胞细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是血红蛋白。
该化合物是由两个α－肽链、两个β－肽链与四个亚铁红素基团构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2与CO2结合的亚铁红素基团。
2.3从红细胞中别离出血红蛋白的过程为：
洗涤红细胞、释放血红蛋白、别离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？
除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的别离纯化。
红细胞的洗涤过程为：血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色
思考：参加柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？
防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。
思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？
参加蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。
补充：参加蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要一样。参加甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放与别离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心别离的方法：
红细胞破碎混合液→中速长时离心〔2000c/min×10min〕→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗别离出血红蛋白
如何除无机盐离子与小分子有机物质呢？。
透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子与小分子能够通过半透膜。
在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子与小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。
思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？
维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。
总结：通过以上四个根本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子〔如呼吸酶等〕。怎样将杂蛋白与血红蛋白别离开来呢？我们来研究蛋白质提取与别离的第二个步骤――粗别离〔凝胶色谱操作〕。
凝胶色谱别离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品参加与洗脱。
根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。
橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。
色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱
下面进展第二步凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：
色谱柱的装填过程。
样品参加与洗脱。其根本过程是：
调节缓冲液面→参加蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质
至此，血红蛋白即可得到粗别离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：
〔1〕红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。
〔2〕凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物与气泡
〔3〕色谱柱的装填：装填尽量严密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。
〔4〕色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。
〔四〕、实验结果分析与评价
1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？
观察你处理的血液样品离心后是否分层〔见教科书图5-18〕，如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高与时间过长，会使白细胞与淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯洁的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以参加大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
3、你能描述血红蛋白别离的完整过程吗？
血红蛋白提取与别离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗别离、纯化与纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗别离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进展纯度鉴定。
4、你能观察到蛋白质的别离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断别离效果？
如果凝胶色谱柱装填得很成功、别离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明别离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
   课堂小结
当今生物科学在蛋白质研究领域的进展，说明提取、别离高纯度的蛋白质的重要性与必要性，进而说明本节课的目的，以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取与别离的一些根本技术，尝试从血液中提取与别离血红蛋白，了解色谱法、电泳法等别离生物大分子的根本原理，为今后学习这些技术带下根底。
   板书
专题五    第三节     血红蛋白质的提取与别离
一、蛋白质分子的差异性
1凝胶色谱法
2缓冲溶液
3凝胶电泳法
二、血红蛋白的提取与别离实验设计
样品处理、粗别离、纯化、纯度鉴定。
三、实验结果分析与评价
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