SC∕T 7206.3-2007 牡蛎单孢子虫病诊断规程 第3部分：原位杂交诊断法(水产).pdf

ICS 65.020.30 B 41 中华人民共和国水产行业标准SC/T 7206.3-2007 牡航单抱子虫病诊断规程第3部分:原位杂交诊断法Dia伊osticProcoIs for Haplosporidiosis of Oyster一Part 3: in situ Hybridization Metbod 2007-06-14发布2007-09-01实施中华人民共和国农业部发布前E SC/ T 72师牡筋单泡子虫病诊断规程分为三个部分.一一第1部分:组织印片的细胞学诊断法;一一第2部分:组织病理学诊断法;一第3部分:原位杂交诊断法。本部分为SC/T7206的第3部分。本部分的附录A为规范性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。SC/ T 7206.3-2007 本部分起草单位.中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳出入境检验检疫局。本部分主要起草人:杨冰、黄健、陈爱平、江育林、王崇明、王秀华、魏琦、刘莉。I SC/ T 7206.3-2007 1 范围牡蜻单袍子虫病诊断规程第3部分:原位杂交诊断法SC/T 7206的本部分规定了牡贩尼氏单泡子虫病的原位杂交诊断方法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分根据尼氏单袍子虫在组织中的定位与感染程度对牡妨单袍子虫病进行确诊。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。SC/ T 7202.3-27斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分组织病理学诊断法SC/T 7205.1-27牡纺包纳米虫病诊断规程第1部分.组织印片的细胞学珍断法SC/ T 7206.1-2007牡甥单泡子虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法3 原理3. 1 牡航尼氏单袍子虫及其病理学特征见SC/T7206.1-27 (牡妨单抱子虫病诊断规程第1部分组织印片的细胞学诊断法)中3.1的规定。3.2 技术原理原位杂交检测方法是以非放射性标记物一-地高辛(DIG)标记的WSSV核酸探针与存在于切片中的WSSVDNA进行核酸分子杂交，并通过抗原一抗体反应和酶-底物的化学显色反应在组织切片上显示出WSSV的存在位点。原位杂交可完整地保持组织与细胞的形态，能在复杂的组织中针对单一细胞进行病毒检测，准确地反映出组织细胞中病毒的分布。4 试剂和材料4. 1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。4.2寡聚核背酸探针MSX1347:序列为:5-ATEKTGT-TGOTGA-CGC-TAA-c3，合成时用地高辛(DIG)标记的脱氧核糖核昔尿略咬残基(D1G-dU)代替脱氧核糖核背胸腺嘀咬残基(dT)。4.3碱位磷酸酶偶联的DIG抗体(AP-抗DIG，O.75UIL，4t:) :生化试剂。4.4 二甲苯。4.5元水乙醇。I 4.6川乙醇。4.7 中性树胶:生物染色用。4 8 石蜡(熔点52t:-54(;)切片级4.9 戴维森氏AFA(Davidsons AFA)固定液按SCIT 7202. 3-2007 (斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分:组织病理学诊断法)附录A的规定。l SC/ T 7206.3-2007 4.10 80%乙醉按SC/T7202. 3-2007 (斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分:组织病理学诊断法)附录A的规定。4.11 70%乙醇按SC/T7202. 3-2007 (斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分:组织病理学诊断法)附录A的规定。4.12 50%乙醇按SC/T7202.3-27 (斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分.组织病理学诊断法)附录A的规定。4.13 500周ImL多聚赖氨酸按附录A的规定。4.14 2XSSC按附录A的规定。4.15 lX汇按附录A的规定。4.16 0.5x挺直二按附录A的规定。4.17 TNE按附录A的规定。4.18 100g/mL蛋白酶K按附录A的规定。4.19 0.4%甲醒按附录A的规定。4.20 杂交缓冲液按附录A的规定。4.21 缓冲液I按附录A规定。4.22 缓冲液E按附录A规定。4.23缓冲液阻按附录A规定。4.24 缓冲液N按附录A规定。4.25 显影液按附录A规定。4.26 0.5%停斯麦棕Y(Bismarkbrown Y)按附录A规定。427 阳性对照为受尼氏单袍子虫感染且组织病理学上有明显病灶的牡妨组织切片(未脱蜡)。4.28 阴性对照为未受尼氏单抱子虫感染且经原位杂交证明为阴性的牡蜘组织切片(未脱蜡)。5 器材和说备5. 1 石蜡切片机:满足4阳-7m厚度的石蜡连续切片要求。5.2 水浴锅室温-100t:，士lt:。5.3 显微镜:带高倍镜(40 x)和汹镜(100 x )。5.4 微量移液器:量程。.5L-I0L，5L-40L、40L-200L、2L-l仅用L各1支。5.5 普通冰箱:具冷藏箱，并带-18t:以下冷冻箱体。5.6 程控组织脱水机或使用手工脱水步骤。5.7 石蜡包埋机或使用手工包埋步骤。5.8 程控切片染色机或使用手工染色步骤。5.9 切片保湿孵育箱:室温-50t:，+1t:或使用自制的简易湿盒放置于恒温箱中。5.10 展片水浴锅:敝口，无盖水浴锅或使用自1M保温盒内加一定温度的水代替。5. 11 平板烘片机:室温-loot:或使用恒温箱代替。5.12 切片染色杯。5.13 医用慑子。5. 14 毛笔。5. 15玻片架。5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 吸管。载玻片。盖玻片。吸水纸。暗盒:可用任何能避免强光直射的盒子。6 操作步6. 1 组织切片制备6. 1. 1 样品的采集按SC/T7205. 1-2007 (牡蜘包纳米虫病诊断规程诊断法)附录B执行。SC/ T 7206.3-2007 第1部分组织印片的细胞学6.1.2 取活体牡勤，沿着牡捕的纵向剖面切取内脏团组织块，置于David田nsAFA固定液中固定24h (固定液的体积应超出样品体积10倍以上)，随后换为70%乙醇保存。组织切片前先要取材切块，将固定样品根据其病灶定位，切削成约3mm-5mm的小块，厚度不超过5rnmo 6. 1 .3按SC/T7202.3-2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分.组织病理学诊断法)中6.2-6.5的规定将样品置于程控组织脱水机中依次进行脱水、透明、浸蜡，完毕后取出在石蜡包埋机上进行包埋。用石蜡切片机进行切片，切片厚度6m，用毛笔将切片移入展片水浴锅内展片，用已被500g/mL多聚赖氨酸预先包被的载玻片将切片捞起，置于温箱中40t:温干过夜。6.2 原位杂交6.2.1 组织切片(包括阴性对照和阳性对照)在程控切片染色机中依次通过二甲苯(2次，10minl/i:)、无水乙醇(2次，10min/次)、95%乙醇(2次，10 sl次)、80%乙醇(2次，10sl次)、50%乙醇(1次，10纱，然后用PBS冲洗6次(勿让切片干燥)。6.2.2 组织切片置于T阳中5min，而后平放在切片保湿孵育箱中，吸取500LlIL!:/mL蛋白酶K溶液，加到每张组织切片上，37t:孵育15mino 6.2.3 把组织切片上的蛋白酶K溶液吸净，然后将其放入预冷到4t:的0.4%甲M溶液中浸5min以终止反应。6.2.4 室温下，用2XSSC浸洗组织切片5min。6.2.5 把组织切片平放在切片保湿孵青箱中，吸取500L杂交缓冲液加到每张组织切片上，42t:孵育30 mino 6.2.6按每张切片500L的体积，在杂交缓冲液中配制l含2nglL的DIG标记的寡聚核昔酸探针的杂交混合液，吸取杂交混合液加到组织切片上，置于90t:-95t:平板烘片机上保温12min，使组织DNA变性。注意补充切片上过度蒸发的杂交缓冲液。6.2.7 把组织切片放在平整的冰面上洋冷5mino 6.2.8 在切片保湿孵育箱内42t:下孵育16h-18 h。6.2.9 依次用缓冲液2X去汇(2.5min，室温)、2x SSC(2.5 min，室温)、l xSSC(2.5 min，室温)、1xSSC(2.5 min，室温)、0.5x SSC(5 min，42t: )、0.5xSSC(5min，但t:)、缓冲液1(5 min，室温)洗组织切片。6.2.10 用5LI片缓冲液E封闭组织切片，37t:温浴30mino 6.2.11 将AP-抗DIG用缓冲液E稀释至0.75单位ImL(1 11.75单位作LAP-抗DIG加到1mL缓冲液E中)，把组织切片平放在湿盒中，每片吸250L已用缓冲液H稀释的AP-抗DlG于组织tJJ片上，37t:温浴1h。6.2. 12 用缓冲液1 (2次，5min/次，室温)、缓冲液皿(2次.5min/次，室温)洗玻片。3 SCIT 7206.3-2007 6.2. 13 吸500L显影液于每张组织切片上，在暗处于室温放置1h-3h。中间可取出短时间在显微镜下观察显色情况，当阳性对照有明显显色时可中止反应，如果阴性对照的组织细胞开始普遍出现非特异性显色，则应立即终止显色。6.2. 14 把组织切片置于缓冲液JV中15min终止反应。6.2.15 组织切片上依次滴加双蒸水(1次，10s)、0.5%傅斯麦棕Y(1次，1min)、95%乙醇(3次，10sl 次) 、无水乙醇(3次，10sl次)、二甲苯(4次，10sl次)。6 2.16 滴加2滴中性树胶封片。6.2.17 在明视野显微镜下寻找蓝黑色到黑色细胞沉淀物并拍照。7 结果判定7. 1 受感染的牡插组织显示阳性反应，即尼氏单袍子虫胞内有较深的蓝黑色颗粒沉淀，而未受感染的牡妨组织则无此沉淀呈现阴性结果。寄生虫感染程度越重，贝IJ着色越明显。7.2若阳性对照未出现相应的阳性反应或阴性对照和阳性对照样品均出现与阳性显色反应程度相当的明显非特异性反应，表明操作过程不符合要求，结果元效，重新取样检测。4 , 1 20 xssc Na 拧糠酸三纳(2H20)加水溶解定容至调节pH至高压蒸气灭菌后，室温贮存。2 2XSSC 20XSSC 水混匀，0.45m滤膜过滤除菌，4t:贮存。3 lXSSC 20XS1到C水混匀，0.45m滤膜过滤除菌，4t:贮存。4 0.5XSl副C20 xS1到2水混匀，0.45m滤膜过滤除菌，4t:贮存。5 10 x缓冲液ITris NaCJ 加水溶解至用浓HCJ调节pH至加双蒸水定容至高压蒸气灭菌，4t:贮存。6 缓冲液IlOX缓冲液I水混匀，0.45m滤膜过滤除菌，4t:贮存。附录A(规范性附录)试剂配方gbgoEMAU句54骂dyy句3句，&吨J，、MOOnu句n只unu1 1 100 rnL 9rnL 50rnL 950 rnL 50mL 1950 rnL 121.1 g 87.7 g 800 rnL 7.5 1000 rnL 100 rnL 900 rnL SC/ T 7206.3-2007 5 SC/ T 7206.3- 2007 7 10 X缓冲液ETris Nal 加水溶解至用浓HCl调节pH至MgCI,.6H20 加双蒸水定容至混匀，0.45阳滤膜过滤除菌，4t:贮存，出现沉淀后丢弃。8 缓冲液E121.1 g 58.4 g 800mL 9.5 101.6 g 1000 mL 10X缓冲液阻loomL 水900mL混匀，0.45m滤膜过滤除菌，4t:贮存，出现沉淀后丢弃。9 NBT贮存液四氮幢蓝(NBT)二甲基甲酸胶水避光，-20t:贮存。10 BCIP贮存液5澳4氯3-P51噪磷酸-甲苯胶盐(BCIP)二甲基甲酸胶避光，一20t:贮存。11 10XTNE Tris l、laClEDTA-2H20 加水溶解至用HCl调pH至加水定容至高压蒸气灭菌后，4t:贮存。12 1NE 10XTNE 水混匀，0.45m滤膜过滤除菌，4t:保存。13 10 n电/mL蛋白酶K蛋白酶K加水定容至6 100mg 0.931 mL 0.402 mL 100 mg 2mL 60.57 g 5.84 g 3.72 g 900mL 7.4 1000 mL loomL 9mL 1mg lOmL 分装于无菌离心管中(0.25mLl管)，-20C下保存。14 100 lLIl/mL蛋白酶K10mg/mL蛋白酶K0.25 mL TNE 24.75 mL 用前临时配制，混匀，4C存放。15 0.4%甲踵甲&(37%)5.4 mL 水500 mL 倒掉前可重复使用4次，用前预冷。16 20 x丹晗特氏液(Denhardts) 牛血清白蛋白(组份5)0.4 g 聚m;糖400(Fi11400) 0.4 g 聚乙烯毗咯烧酬360(PVP360) 0.4 g 加水溶解并定容至1mL 0.45阳n的滤器过滤，5mL/支分装，-20C贮存。17 25%硫醺葡JIf糖硫酸葡聚糖(Dextransu!fate) 25 g 加水定容至100mL 低热搅拌片刻使之溶解，-20C保存。18 10 n电/mL篮精DNA锺精DNA250mg 水25mLSC/ T 7206.3-2007 将继精DNA销盐加入水中，用玻璃棒搅拌直至完全溶解。用6号针头的注射器反复拍打数次。在100C水浴中加热10rnin，立即放于冰浴中淳冷，分装于无菌小试管中，-20C保存。使用前在100C水浴中加热5min，然后洋玲。19 杂交缓冲液20X佼汇IOmL 100%甲酸胶25mL 20X丹哈特氏液2.5 mL 10mg/mL蛙精DNA2.5 mL 25%硫酸葡聚糖10mL 混匀，4C贮存。20 缓冲液E封闭剂。5g缓冲液1100 mL 在60C-80C水浴中溶解，不断晃动，直至颗粒溶解。4C可贮存2周。7 SC/ T 7206.3-2007 21 10 x缓冲液NTris 12.1 g EDTA-Na22H2 3.7 g 加水溶解，并定容至10mL 用HCl调pH至8.0，高压灭菌。4t贮存。22 缓冲液N10 x缓冲液N100mL 水900mL 混匀，0.45m滤膜过滤除菌。4t贮存。 23 10%藏Z烯酶聚乙烯醇(分子量300-70000)10g 加水溶解至100mL 搅拌溶解后，分装10mLI管，-20t贮存。24 显影液缓冲液皿90mL 盐酸左旋咪喽24 mg 10%聚乙烯醇10mL 4t保存用前在每1mL上述混合液中加入:NB才贮存液4.5L BCIP贮存液3. 5L 25 0.5%僻斯麦棕Y傅斯麦棕Y(Bismark Brown Y) 2.5 g 水500mL 把染料溶于水中，过滤。室温贮存。26 500附ImL多.赖氨隘多聚赖氨酸(分子量250)5mg 水10mL 溶解后，4t贮存。8