1、 ICS 65.020.20 CCS B 16 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 33802024 马铃薯镰刀属真菌病害检测技术规程 Technical code for detection of fusarium fungi disease in potato 2024-03-15 发布 2024-04-15 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 33802024 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区马铃薯标准化技术委员会(SAM/TC 40)
2、归口。本文件起草单位:内蒙古自治区农牧业科学院,内蒙古农业大学,乌兰察布市农林科学研究所、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、喀喇沁旗农牧局、武川县农牧技术推广中心。本文件主要起草人:赵远征、徐利敏、王东、周洪友、邱廷艳、张晓明、王真、王玉凤、贾瑞芳、谢锐、邱鑫泽、牟英男、陈文晋、肖皓文、张宇。DB15/T 33802024 1 马铃薯镰刀属真菌病害检测技术规程 1 范围 本文件规定了马铃薯镰刀属真菌病害检测的原理、仪器设备和用具、形态检验、致病性测定、PCR检验、样品复检等技术要求和方法。本文件适用于马铃薯镰刀属真菌病害的检测。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件
3、必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T 2729 马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 原理 镰刀属真菌(Fusarium spp.)是一种重要的植物病原菌,属无性真菌类,有性时期为子囊菌门。镰刀属真菌主要危害马铃薯植株和块茎。本标准以病原菌在植株和块茎上的危害症状,菌落、孢子等形态学特征,回接致病性测定及PCR反应结果为鉴定依据,将上述各项措施综合形成一套检测技术体系。5 仪器设备和用具 仪器设备 超净工作台、显微镜、高压灭菌锅、光照培养箱、PC
4、R仪、离心机、凝胶电泳仪、漩涡震荡仪、水浴锅、凝胶成像系统、分析天平。检测工具 接种针、手术刀、镊子、挑针、载玻片、盖玻片、滴管、离心管、培养皿、三角瓶、酒精灯。6 形态检验 调查取样 选取田间萎蔫、干枯发病植株,观察根部腐烂情况,检查是否褐变或出现白色菌丝体;剖开根茎处维管束观察是否出现黄化或褐变;田间或窖藏观察马铃薯块茎病变情况,在块茎脐部下方2 cm左右处横DB15/T 33802024 2 切,或切取表皮凹陷病斑处进行观察,观察是否出现维管束褐变,块茎中空或腐烂并伴随白色菌丝层。将具有典型特征的病株、病薯取样。病原菌分离培养和纯化 将病样表面清洗晾干,选择病斑附近的病健交界处,切取0.
5、3 cm0.3 cm0.1 cm大小的薄片,75%酒精消毒30 s,用无菌滤纸吸干,在0.1%次氯酸钠浸泡2 min,再用无菌水冲洗3次。待组织干燥后置于PDA培养基上,在25 恒温下光照、黑暗交替各12 h培养5 d。待组织长出菌丝后,挑取菌丝体转移到新的PDA培养基上进行培养。待菌落长至培养皿2/3时,采用平板稀释法进行单孢分离,并获得纯培养。病原菌形态学鉴定 将PDA培养基上培养7 d的菌落拍照并观察其形态,典型菌落气生菌丝多呈絮状或毡状,白色、紫色、淡粉色或黄白色。利用挑针挑取少量菌组织,载玻片上以水浮载制成玻片,显微镜下观察孢子形态,小型分生孢子呈卵圆形或椭圆形,单孢,大小2 m4
6、m4 m8 m;大型分生孢子略弯曲,镰刀形或月牙形,25个分隔,多为3个分隔,大小3 m8 m11 m70 m;厚垣孢子球形,表面不光滑,单生或串生。7 致病性测定 将纯培养物配制成孢子悬浮液,伤口接种法进行马铃薯植株和薯块回接,接种28 d后观察马铃薯的发病情况。如出现与病样一致的症状则判定病原菌能够引起该病害发生。8 PCR 检验 DNA 提取 按照SN/T 2729,采用CTAB法提取菌株基因组DNA。对照设置 以马铃薯枯萎病病原菌DNA作为阳性对照,以不添加DNA模板反应体系作为阴性对照。PCR 扩增 以菌株DNA为模板,利用镰刀菌属真菌的特异性引物EF-1H:(5-ATGGGTAAG
7、GAAGACAAGAC-3),EF-2T:(5-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3)进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25 L,其中模板DNA 1 L,上下游引物各1 L,2Easy Taq PCR Super Mix 12.5 L,ddH2O 9.5 L。PCR扩增程序:95 预变性5 min;95 30 s,58 退火45 s,72 延伸1 min,循环35次;72 延伸5 min。结果判定 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增出长度介于700 bp750 bp之间的清晰单一条带,与阳性对照一致。9 样品复检 DB15/T 33802024 3 样品检测不成功需要复检,病样
8、置于冰箱-20 冷冻以备样品检测不成功进行复检,工作完成后集中灭活处理。DB15/T 33802024 4 A A 附录A (规范性)培养配方、DNA 提取方法及发病症状 A.1 培养基配方 WA 培养基:琼脂 15 g,蒸馏水定容至 1000 mL。PDA 培养基:马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,琼脂 15 g,蒸馏水定容至 1000 mL。A.2 CTAB 法 CTAB 法如下所示:a)将植物组织置于 2 mL 离心管,加入 2 颗灭菌钢珠,液氮冷冻,球磨仪研碎;b)加入 800 L CTAB 提取缓冲液,65 水浴 1 h,期间每隔 15 min 颠倒混匀若干次;c)加入 800
9、L 苯酚:氯仿:异丙醇(25:24:1),上下颠倒混匀,12000 rpm 离心 10 min,将上层水相转移至新的 2 mL 离心管;d)加入等体积氯仿:异丙醇(24:1),上下颠倒混匀,12000 rpm 离心 10 min,将上清转移至新的 1.5 mL 离心管;e)加入 0.6 倍体积异丙醇,-20 沉淀 30 min 以上;f)12000 rpm 离心 10 min,弃去上清,加入 75%乙醇洗涤两次;g)真空干燥仪干燥 40 min 左右,加水溶解 DNA。A.3 病害症状 植株症状:苗期主要导致马铃薯根部腐烂,根部褐变,植株萎蔫,严重时根部出现白色菌丝层;开花期前后主要导致植株萎蔫、枯萎,植株维管束出现褐变。块茎症状:病斑多发生于薯块脐部。发病初期块茎表面出现浅褐色病斑,病斑缓慢扩展,随后扩大形成较多轮纹状褶皱、凹陷;后期块茎内部变空,干燥时内部长满白色菌丝,整个薯块变硬、变轻、干缩,易碎呈灰褐色或深棕色病变。DB15/T 33802024 5 B B 附录B (资料性)镰刀属真菌形态 B.1 镰刀属真菌孢子形态图见图 B.1。图B.1 镰刀属真菌孢子形态图 B.2 镰刀属真菌菌落形态图见图 B.2。图B.2 镰刀属真菌菌落形态图