一株食源性蜡样芽孢杆菌的分...疫相关因子和肠道菌群的影响_高丽.pdf

高丽 等/一株食源性蜡样芽孢杆菌的分离及其对小鼠肠黏膜免疫相关因子和肠道菌群的影响 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1759-1772 DOI:10.13345/j.cjb.220755 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：国家重点研发计划(2020YFC1606800)；包头师范学院高层次人才引进科研启动基金(BTTCRCQD2018-001)；内蒙古自治区自然科学基金(2020MS08075)This work was supported by the National Key Research and Development Program of China(2020YFC1606800),the High-level Talents Introduced Scientific Research Startup Fund Project of Baotou Teachers College(BTTCRCQD2018-001),and the Inner Mongolia Autonomous Region Natural Science Foundation(2020MS08075).#These authors contributed equally to this work.*Corresponding author.E-mail: Received:2022-09-19;Accepted:2023-01-17;Published online:2023-01-19 1759 生物工程学报 一株食源性蜡样芽孢杆菌的分离及其对小鼠肠 黏膜免疫相关因子和肠道菌群的影响 高丽1#，何珊2#，王利利1，刘宇婷1，温彤1*1 包头师范学院 生物科学与技术学院，内蒙古 包头 014030 2 包头医学院 医学技术与麻醉学院，内蒙古 包头 014040 高丽,何珊,王利利,刘宇婷,温彤.一株食源性蜡样芽孢杆菌的分离及其对小鼠肠黏膜免疫相关因子和肠道菌群的影响J.生物工程学报,2023,39(4):1759-1772.GAO Li,HE Shan,WANG Lili,LIU Yuting,WEN Tong.Isolation of a foodborne Bacillus cereus strain and its effect on intestinal mucosal immunity-associated factors and gut microbial community in miceJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1759-1772.摘 要：蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种常见的食源性致病菌，误食被其污染的食品会引起呕吐或者腹泻，严重者还会死亡。本研究利用划线培养法从腐败米饭中分离培养出一株蜡样芽孢杆菌。通过药敏试验分析及毒力相关基因 PCR 扩增对其致病性及耐药性进行分析，并将细菌培养物经过腹腔注射进行小鼠感染试验，检测其对小鼠肠黏膜免疫相关因子和肠道菌群的影响，从而分析该病原菌的致病途径及防治手段。结果显示，本研究所分离的食源性蜡样芽孢杆菌，对诺氟沙星、呋喃妥因、四环素、米诺环素、环丙沙星、大观霉素、克林霉素、红霉素、克拉霉素、氯霉素、左氟沙星和万古霉素敏感，对复方新诺明、苯唑西林和青霉素 G 具有耐受性。该菌株携带hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC 和 entFM 7 种毒力相关基因，可产生致腹泻型毒素。小鼠感染后，出现腹泻，肠黏膜免疫球蛋白和炎性因子表达水平显著上调；肠道菌群检测结果表明，经该蜡样芽孢杆菌感染后，小鼠肠道菌群组成发生变化，标志着机体健康的拟杆菌门(Bacteroidetes)中的 uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae 丰度显著下降，而标志着菌群失调的变形菌门(Proteobacteria)条件致病菌 uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae 丰度显著升高，且与 IgM 和IgG 呈显著正相关(P2.0)，具体方法为：首先采用非参数因子 Kruskal-Wallis检验检测不同分组间丰度差异显著的物种，再利用Wilcoxon秩和检验检查显著差异物种中的所有亚种是否趋于同一分类级别，最后使用线性判别分析(LDA)对数据进行评估，识别差异最显著的物种(LDA2.0,P0.05)。通过冗余判别分析(redundancy discriminant analysis,RDA)分析免疫相关因子对样本微生物群落组成的作用，通过置换检验(permutation test)检测其作用的显著性。通过 Pearson 相关性分析连接微生物群落和免疫相关因子之间的标记物种，使用双尾检验(bivariate)法检测其相关性是否显著。P0.05 为差异有统计学意义。2 结果与分析 2.1 蜡样芽孢杆菌的分离鉴定 分离出的一株单菌落命名为 M9，对其进行形态学观察，该菌落为白色扁平近似圆形，且表面粗糙，符合蜡样芽孢杆菌形态特征(图 1A)。对其进行革兰氏染色鉴定，结果显示，菌体呈现紫色，表明该菌株为革兰氏阳性菌(图 1B)。生化鉴定结果显示，该菌株可以发酵蔗糖和葡萄糖，而无法发酵甘露醇和乳糖。通过对 M9 菌株的 16S rRNA 基因进行扩增测序，并通过 BLAST 比对，确定 M9 与已知的蜡样芽孢杆菌序列同源性最高，表明该分离的菌株为蜡样芽孢杆菌。2.2 蜡样芽孢杆菌抗药性分析 通过药敏纸片 K-B 方法分析所分离株 M9的耐药性，结果如表 2 所示，该蜡样芽孢杆菌菌株对诺氟沙星、呋喃妥因、四环素、米诺环素、环丙沙星、大观霉素、克林霉素、红霉素、克拉霉素、氯霉素、左氟沙星和万古霉素等抗生素敏感，对复方新诺明、苯唑西林和青霉素G 具有耐药性。图1 蜡样芽孢杆菌分离株M9的分离鉴定 A：蜡样芽孢杆菌菌落形态.B：蜡样芽孢杆菌革兰氏染色图(1 000)Figure 1 Isolation and identification of Bacillus cereus strain M9.A:Colony morphology.B:Gram stain(1 000).ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1764 2.3 细菌毒力相关基因鉴定 通过 PCR 技术对所分离 M9 蜡样芽孢杆菌的 8 个毒力相关基因进行检测，检测结果如图 2 所示，该菌株携带 hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC 和 entFM 7 种毒力相关基因，不携带 Ces 基因。因此，该菌株可产生致腹泻型毒素，且致病性强，容易造成食物中毒。表 2 分离菌株的药物敏感性试验 Table 2 Antimicrobial susceptibility test of the isolated strains Name of drugs Sensitivity standard for diameter of inhibition Diameter of inhibition zone(mm)Sensitivity Resistant(R)Intermediate(I)Sensitive(S)Bactrim 10 1015 16 0 R Norfloxacin 12 1316 17 20 S Nitrofurantoin 14 1516 17 20 S Oxacillin 10 1112 13 0 R Tetracycline 14 1518 19 30 S Minocycline 14 1518 19 32 S Ciprofloxacin 15 1620 21 31 S Spectinomycin 14 1517 18 23 S Penicillin G 28 29 10 R Clindamycin 14 1520 21 26 S Erythrocin 13 1422 23 31 S Clarithromycin 13 1417 18 35 S Chloramphenicol 12 1317 18 26 S Levofloxacin 13 1416 17 32 S Vancomycin 14 15 22 S 图 2 蜡样芽孢杆菌分离株 M9 的毒力相关基因鉴定 A：hblA.B：hblC.C：hblD.D：entFM.E：nheA.F：nheB.G：nheC.H：Ces.M：DL2000 DNA marker；13：目的基因；4：阴性对照 Figure 2 Identification of the virulence-associated genes in the isolated Bacillus cereus strain M9.A:hblA.B:hblC.C:hblD.D:entFM.E:nheA.F:nheB.G:nheC.H:Ces.M:DL2000 DNA marker;Lanes 13:Target gene;Lane 4:Negative control.高丽 等/一株食源性蜡样芽孢杆菌的分离及其对小鼠肠黏膜免疫相关因子和肠道菌群的影响 ：010-64807509： 1765 2.4 食源性蜡样芽孢杆菌在小鼠组织中的定殖情况 感染试验期间，感染小鼠并未出现死亡现象，但在感染后 5 d 左右出现腹泻症状。结果如图 3 所示，在小鼠各组织中均检测到了蜡样芽孢杆菌 16S rRNA 基因片段，证明感染后蜡样芽孢杆菌在小鼠各组织中都出现了定殖。2.5 食源性蜡样芽孢杆菌对小鼠肠黏膜免疫相关因子的影响 通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定蜡样芽孢杆菌感染对小鼠肠黏膜分泌型免疫球蛋白和炎性因子表达水平的影响。结果如图 4 所示，与对照组相比，感染组小鼠肠黏膜免疫球蛋白IgA(30.943.24)vs.(18.763.36)ng/g、IgG(69.0415.12)vs.(35.976.850 ng/g)和 IgM(18.842.94)vs.(9.682.45)ng/g表达水平均显著上调(P0.05)，肠黏膜炎性因子 IL-2(22.502.71)vs.(12.812.37)ng/g、IL-6(23.002.37)vs.(14.441.57)ng/g和 TNF-(27.172.50)vs.(14.402.16)ng/g的表达水平 图 3 蜡样芽孢杆菌分离株 M9 在小鼠各组织中的定殖 A：蜡样芽孢杆菌在感染小鼠各组织中的定殖.M：DL5000 DNA marker；1：肝；2：脾；3：胃；4：肺；5：肠.B：蜡样芽孢杆菌在对照小鼠各组织中的定殖.M：DL5000 DNA marker；0：阳性对照；1：肝；2：脾；3：胃；4：肺；5：肠 Figure 3 Colonization of the isolated Bacillus cereus strain M9 in various tissues of the infected mice.A:B.cereus colonization in each tissue of mice in the infected group.M:DL5000 DNA marker;1:Liver;2:Spleen;3:Stomach;4:Lung;5:Intestinal.B:B.cereus colonization in each tissue of mice in the control group.M:DL5000 DNA marker;0:Positive control;1:Liver;2:Spleen;3:Stomach;4:Lung;5:Intestinal.图 4 蜡样芽孢杆菌分离株 M9 感染后对小鼠肠黏膜免疫相关因子的影响 *：P0.05；*：P0.01；*：P0.001.MB：对照组；MA：感染组 Figure 4 Effect of the isolated Bacillus cereus strain M9 on intestinal mucosal immunity-associated factors in mice.*:P0.05;*:P0.01;*:P0.001.MB:Control;MA:Infected group.ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1766 显 著 上 调(P0.05)。表明该蜡样芽孢杆菌感染会激活机体免疫系统功能，并诱发炎症反应。2.6 食源性蜡样芽孢杆菌感染对小鼠肠道菌群 多样性和 多样性的影响 采用 多样性指数 Chao1、ACE、Shannon和 Simpson 指数分析感染组和对照组细菌群落分布的丰富度和多样性，结果显示，对照组(MB)和 感 染 组(MA)样 本 中 细 菌 的 Chao1 指 数(478.49.2286.76 和 502.7893.47，P=0.68)，ACE 指 数(473.6787.86 和 502.3990.06，P=0.62)，Simpson 指数(0.970.01 和 0.880.11，P=0.15)和 Shannon 指数(5.990.37 和 5.19 1.56，P=0.32)均差异不显著(图 5A5D)，表明蜡样芽孢杆菌感染不会显著影响小鼠肠道菌群的丰富度和多样性。采用 多样性分析来阐述蜡样芽孢杆菌感染对小鼠肠道菌群组成的影响，结果显示，除 MB5 外，感染组和对照组样本均存在聚类趋势(图 5E、5F)，表明蜡样芽孢杆菌感染会导致小鼠肠道菌群组成发生改变。2.7 食源性蜡样芽孢杆菌感染对小鼠肠道菌群组成的影响 为了分析蜡样芽孢杆菌感染对小鼠肠道菌群组成的影响，统计了对照组和感染组小鼠粪便样本中丰度大于 1%的细菌信息。基于门水平的分析结果如图 6A，各样本共鉴定出18 个细菌门，蜡样芽孢杆菌感染后，感染组小 图 5 不同组小鼠肠道菌群的 多样性和 多样性分析 A：Chao1 指数.B：ACE 指数.C：Simpson指数.D：Shannon 指数.E：NMDS 分析.F：UPGMA 树状图.MB：对照组；MA：感染组 Figure 5 Alpha and beta diversity analysis of gut bacterial communities in different groups of mice.A:Chao1 index.B:ACE index.C:Simpson index.D:Shannon index.E:NMDS analysis.F:UPGMA dendrogram.MB:Control;MA:Infected group.高丽 等/一株食源性蜡样芽孢杆菌的分离及其对小鼠肠黏膜免疫相关因子和肠道菌群的影响 ：010-64807509： 1767 图 6 蜡样芽孢杆菌分离株 M9 处理对小鼠肠道菌群组成的影响 A：门水平上不同组小鼠肠道菌群的丰富度.B：属水平上不同组小鼠肠道菌群的丰富度.C：门水平丰度具有显著差异的微生物.*:P0.05.D：属水平丰度具有显著差异的微生物.*:P0.05;*P2.0,P0.05 Figure 6 Effect of the isolated Bacillus cereus strain M9 treatment on gut microbial composition in mice.A:Histogram of species abundances at the phylum level.B:Histogram of species abundances at the genus level.C:Bacteria with significant differences in abundance at the phylum level.*:P0.05.D:Bacteria with significant differences in abundance at the genus level.*:P0.05,*:P2.0,P2.0,P0.05)。通过 Pearson 相关系数分别分析两组小鼠肠道菌群在门和属水平上与肠黏膜免疫相关因子指标的相关性，如图所示，在门水平上(图 7B)，变形菌门(Proteobacteria)与 IgM 和IgG 呈显著正相关(P0.05)。在属水平上(图 7C)，uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae 与 IgM和 IgG 呈 显 著 正 相 关(P0.05)，异 杆 菌 属(Allobaculum)与 IgG 呈显著负相关(P0.05)。3 讨论 蜡样芽孢杆菌由于能够导致多种疾病而被广泛关注22-24，其能够引起全身性和局部感染，在免疫功能缺陷个体中感染能够导致宿主死亡25。蜡样芽孢杆菌最常引起的是以腹泻和呕吐为主要症状的食源性疾病，分别由腹泻相关毒素(HBL,NHE,CYTK)和呕吐毒素引起26-27。毒力相关基因检测结果表明本研究所分离的蜡样芽孢杆菌携带的毒力相关基因有 hblA、hblC、hblD、nheA、nheB、nheC、entFM，未检测到Ces 基因，表明该蜡样芽孢杆菌为腹泻型，且具有强致病性。对小鼠进行感染试验，感染组小鼠在腹腔注射后 5 d 左右开始出现腹泻症状，与该菌株所携带的毒力相关基因类型相符合。直到感染后 10 d，仍未出现死亡个体，由于本研究分离细菌与易华山等21分离的乳源性蜡样芽孢杆菌所携带的毒力相关基因一致，所以其 高丽 等/一株食源性蜡样芽孢杆菌的分离及其对小鼠肠黏膜免疫相关因子和肠道菌群的影响 ：010-64807509： 1769 图 7 各组小鼠肠道菌群与肠黏膜免疫相关因子之间的相关性分析 A：RDA 分析.B：门水平丰度大于 1%的细菌与肠黏膜免疫相关因子 Pearson 相关性分析.C：属水平丰度大于 1%的细菌与肠黏膜免疫相关因子 Pearson 相关性分析.*：P0.05，*：P0.01，*：P0.001 Figure 7 Correlation analysis between mouse gut microbiota and intestinal mucosal immunity-associated factors.A:RDA analysis.B:Pearsons correlation analysis of bacteria with the abundance higher than 1%in the phylum level and intestinal mucosal immunity-associated factors.C:Pearsons correlation analysis of bacteria with the abundance higher than 1%in the genus level and intestinal mucosal immunity-associated factors.*:P0.05,*:P0.01,*:P0.001.对小鼠的致病性可能相似，本研究所用细菌浓度为其研究中的次剂量组，在他们的研究中，该浓度感染小鼠后，致死作用出现在 11 d 之后，因此，感染菌液浓度低可能是本研究中小鼠未出现死亡现象的原因。肠道是机体免疫防御的重要防线，人体免疫系统有 2/3 都分布在肠道内28。细菌感染后会激活机体免疫系统，作为肠道的第一层屏障，肠道黏液层可在被激活后通过分泌 IgA 等免疫球蛋白29-30保护机体，同时会通过激活炎性因子引发炎症反应从而抵抗外界细菌感染，清除细胞外的病原菌31。本研究在蜡样芽孢杆菌感染 10 d 后采集了小鼠肠黏膜，检测其免疫相关因子表达情况，从而探讨致病性蜡样芽孢杆菌感染对小鼠免疫系统的影响。结果显示感染组小鼠肠黏膜免疫相关因子 IgA、IgG、IgM 和肠黏膜炎性因子 IL-2、IL-6、TNF-的表达水平均上调，表明该蜡样芽孢杆菌感染会激活肠道免疫系统功能，并引发炎症反应，抵御外界细菌感染。肠道菌群是一个极其复杂的群体，这些丰富多样的微生物具有极其重要的生理功能。近年来的研究表明，肠道菌群对于宿主免疫系统的发育和维持起至关重要的作用19。在本研究 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1770 中，检测了蜡样芽孢杆菌感染后小鼠肠道菌群的变化，结果表明蜡样芽孢杆菌感染后，小鼠肠道菌群 多样性没有显著变化，即蜡样芽孢杆菌感染并未引起肠道菌群多样性的变化。但是感染组小鼠和对照组小鼠相比，微生物群落的组成发生了变化。感染组小鼠肠道菌群中拟杆菌门(Bacteroidetes)中的 uncultured_ bacterium_f_Muribaculaceae 细菌属丰度显著下调，uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae 是一种在高脂小鼠模型中显著下调的细菌属，表明其丰度下降与机体疾病发生具有一定关联性32-33，在本研究中，蜡样芽孢杆菌感染后其丰度显著下调，表明蜡样芽孢杆菌感染后使机体处于非健康状态。另外，肠道菌群分析结果显示，当蜡样芽孢杆菌感染后，变形菌门(Proteobacteria)中 肠 杆 菌 科 细 菌uncultured_bacterium_f_ Enterobacteriaceae 丰度显著升高。研究表明，变形菌门是胃肠道中一类适应性强、具有潜在致病性的常见菌34，其丰度变化可直接对宿主健康产生影响，哺乳动物肠道菌群失调通常伴随着变形菌门丰度的升高35，所以本研究结果提示蜡样芽孢杆菌感染后，小鼠会出现肠道菌群失调，并诱发肠道相关疾病，对机体健康产生不利影响。通过免疫相关因子和肠道菌群的关联性分析结果表明，变形菌门细菌 uncultured_ bacterium_f_Enterobacteriaceae 与 IgM 和 IgG 呈显著正相关，表明机体菌群失调后会诱发机体免疫反应，防御细菌感染。4 结论 本研究成功从腐败米饭中分离出一株蜡样芽孢杆菌，其对诺氟沙星、呋喃妥因、四环素、米诺环素、环丙沙星、大观霉素、克林霉素、红霉素、克拉霉素、氯霉素、左氟沙星和万古霉素等抗生素敏感，对复方新诺明、苯唑西林和青霉素 G 具有较强耐药性。该菌株携带致腹泻型毒素，且致病性强，容易造成食物中毒。攻毒结果显示，受该菌感染后，小鼠会出现明显的腹泻症状，且肠道菌群组成发生变化，属于拟杆菌门(Bacteroidetes)的标志机体健康的微生物 uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae 在攻毒组小鼠肠道中丰度显著下降，而变形菌门(Proteobacteria)中的标志着菌群失调的条件致病菌 uncultured_bacterium_f_Enterobacteriaceae丰度显著升高。此外机体菌群失调后会诱发免疫反应，防御细菌感染。REFERENCES 1 张明明,梁美丹,肖剑,张彬彬,蒋佳希,宋安华.即食米面制品中蜡样芽胞杆菌分离鉴定及毒力基因研究J.食品工业科技,2019,40(22):144-150.ZHANG MM,LIANG MD,XIAO J,ZHANG BB,JIANG JX,SONG AH.Isolation,identification 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