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环境相关浓度双酚 暴露对成年雌性弓背青鳉生长和生殖的毒性效应黄泽胤，谢明花，陈月碧，黎学友，郭昱嵩，王中铎，董忠典（广东海洋大学水产学院 南海水产经济动物增养殖重点实验室，广东湛江；湖南师范大学生命科学学院 省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，湖南长沙）摘要 以成年雌性弓背青鳉（）为研究对象，研究了不同环境相关浓度（、和 ）双酚（）短期暴露对其生存、生长和生殖的影响。结果表明，暴露 极显著降低了成年雌性弓背青鳉的存活率和生长状况因子；和 暴露导致成年雌性弓背青鳉肝细胞排列松散、脂肪积累减少，暴露还导致肝细胞形态出现明显肿胀；暴露导致其卵母细胞大多停留在初级卵母细胞阶段，抑制了卵母细胞的成熟。另外，暴露显著或极显著上调了、和 在肝脏中的转录水平以及、和 在卵巢中的转录水平。不同环境相关浓度的 暴露对成年弓背青鳉雌鱼有较强的致死效应、生长抑制效应、雌激素效应，并可引起肝损伤和卵母细胞发生障碍。关键词 弓背青鳉；内分泌干扰物；双酚；雌激素效应；生殖毒性中图分类号 文献标识码 文章编号（）：开放科学（资源服务）标识码（）：，（，）（，），；基金项目 国家自然科学基金项目（，）；大学生创新训练项目（）；广东海洋大学南海学者项目（，）；省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室开放课题（）。作者简介 黄泽胤（），男，广东中山人，研究方向：水产养殖学。通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事水产动物健康养殖与水生环境毒理学研究。收稿日期 内分泌干扰物（，）污染已被列为继臭氧层空洞和地球变暖之后迫切需要治理的环境污染问题。双酚（，）是最常见的内分泌干扰物，具有类雌激素效应、神经毒性、遗传毒性和生殖毒性等，目前已被多个地区和行业禁用。双酚（，）又名六氟双酚，是一种新型的含氟双酚类物质，也是 的主要替代物之一。它在工业上主要用作氟橡胶硫化促进剂，也可用于电子产品、光纤、食品包装盒加工、医药中间体等。随着 用量的增加，在产品的制造、消费和废弃过程中 不可避免会释放到各类环境介质中，。水体作为容纳 的主要介质，近年来水体中 含量呈现增加的趋势。德国地表水中 的浓度为 ；嘉兴市 工厂附近河水中 浓度高达 。年，美国 个污水处理厂污水污泥样品中 检出率为，干重 。目前饮用水中 的相关报道较少，但 在水源和饮用水样本中的检出率仅次于。等在瓶装碳酸饮料样品中也检测到。研究表明，具有内分泌干扰效应、生殖毒性、生长和发育毒性以及神经毒性。尽管现阶段水环境中 含量较低，但 具有半衰期长、易富集、难降解等特性，同时由于其 基团具有更高的电负性和活性，即使低剂量的 也可能具有更高的结合激素受体潜力，严重威胁水生生物的健康。污染物的毒性受水体理化因子的影响，同一种污染物在不同盐度、温度、等环境条件下可能具有不同的毒性，此外不同的物种对相同污染物的敏感度也可能存在差异。目前对 的水生生态毒理研究主要集中在斑马鱼上，。若要准确评估 的水生生态风险，有必要开展 暴露对不同种类水生生物的生态毒性效应研究。弓背青鳉（）体型小、适盐范围广、易于实验室养殖、世代周期短、产卵量大、胚胎发育透明且遗传性别明确，是理想的海洋环境监测模型。研究环境相关浓度 对弓背青鳉生长和生殖的影响，有助于阐明 对鱼类的内分泌干扰效应机制，也为确定水体中 的安全浓度提供支持。笔者以雌性弓背青鳉成鱼为研究对象，使用不同环境浓度的 对其进行短期暴露，从个体、组织、细胞、分子水平研究 暴露对弓背青鳉生存、生长、组织安徽农业科学，（）：结构及繁殖相关基因转录表达的影响，旨在为全面评估 的生态风险提供科学依据。材料与方法 试验材料 试验所用弓背青鳉为南海水产经济动物增养殖重点实验室繁育的高桥群体 代成年雌鱼（月龄），试验水体为经过曝气的自来水。养殖水温为（），光暗周期为 ，每天投喂新鲜孵化的丰年虫（）次。（）购自 公司。取适量 粉末溶于二甲基亚砜（，国 产 分 析 纯），配 制 浓 度 分 别 为、和 的储存液，用棕色玻璃瓶储存，并置于 冰箱中暗处，备用。暴露试验设计 选取 条生长规格一致、健康的成年雌性弓背青鳉用于 暴露试验；选取 的玻璃缸作为暴露容器，暴露溶液体积为 ，每缸随机放入 条弓背青鳉。将弓背青鳉暴露于不同环境相关浓度（、和 ）的（即 暴露处理组），另设置对照组（含的）。所有 暴露处理组均含有（水）的。每个处理设置 个平行，试验暴露周期为 ，暴露水体每 全部更新。试验过程中水温、光照周期和投喂方式与常规饲养保持一致。暴露期间，每天用一次性吸管吸取残饵和粪便，挑出并记录死亡个体。分别在暴露第 天和第 天从每个玻璃缸中取相同体积暴露 的水体和新更换的水体，混合后送至广东省科学院测试分析研究所（中国广州分析测试中心）测定暴露水体中 的浓度。暴露结束后，将所有鱼置于冰上麻醉后立刻测量鱼的体长和湿重，计算生长状况因子（，）。生长状况因子计算公式为 湿重（体长）。测量结束后解剖，取肝脏和卵巢组织：肝脏和卵巢组织分成 份，份置于 的多聚甲醛（）中，用于组织切片制备；另 份置于 中，用于总 提取。组织切片制备和总 提取将获得的部分肝脏和卵巢组织于 的 中固定 ，随后进行乙醇溶液系列脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片（厚度 ）、苏木精伊红（）染色，置于光学显微镜下观察并拍照。取用 保存的肝脏和卵巢组织，参照 试剂盒（，美国）说明书提取总，通过琼脂糖凝胶电泳检测总 的完整性；然后，使用美国 （赛默飞，美国）测定总 样品的 。所有 样品 和条带清晰，为，符合后续试验要求。制备和荧光定量分析参照 （诺唯赞，南京）使用说明书，配制反转录体系，使用 仪进行反转录，获得。将获得的 用双蒸水（）稀释 倍，下保存备用。参考笔者所在实验室弓背青鳉转录组数据，获取部分与生殖相关的基因序列，并设计荧光定量引物（表）。反应在罗氏 荧光定量 仪上运行，反应体系共 ，包括 （全 式 金，北 京），上下游引物（）各 ，。反应程序如下：预变性 ；，（收集荧光），个循环；随后进行熔解曲线分析。以 和 为内参基因，对目的基因进行归一化处理。定量结果采用 方法评估目的基因相对于对照组的相对表达量。表 试验所用引物 序号基因名称 引物序列（）（）为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 为；为 数据统计与分析 试验数据均以平均值标准差的形式表示，使用 软件进行数据统计分析并绘图。采用单因素 检验分析方法中的 多重比较，分析对照组与 暴露处理组各数据的差异显著性。结果与分析 在暴露水体中的实际浓度 如表 所示，在 安徽农业科学 年暴露过程中的浓度保持稳定，个 处理组在试验过程中 实际浓度分别为、和 ，实测浓度与理论浓度接近；在对照组中未检测到，说明试验水体未被 污染。所有处理组 暴露浓度均以实测浓度表示。暴露对雌性弓背青鳉成鱼生存、生长的影响 和 的 暴露处理 未对雌性弓背青鳉成鱼的生存造成影响，而 的 暴露处理极显著降低了弓背青鳉的存活率（图）。各浓度 暴露没有对弓背青鳉体长和体重造成显著影响（图、），但 暴露极显著降低了弓背青鳉生长状况因子（图）。表 在暴露溶液中的理论浓度和实测浓度 单位：组别理论浓度实测浓度对照组 （）组 组 组 注：表示差异极显著（）。：（）图 不同浓度 处理组中成年雌性弓背青鳉成鱼的存活率（）、体长（）、体重（）和生长状况因子（）（），（），（）（）暴露对雌性弓背青鳉成鱼肝脏和卵巢组织学结构的影响 暴露处理 后弓背青鳉肝脏组织学结构（图）在形态上与对照组（图）相比没有明显差异，肝细胞呈多边形且排列紧密，仅脂肪含量与对照组相比略有降低；和 暴露处理组肝细胞排列松散，肝脏细胞间间隙增大，脂肪含量降低（图、）；暴露还导致肝细胞出现明显的肿胀和形状改变（图）。对照组弓背青鳉的卵巢含有各期卵母细胞（图），暴露处理未对卵巢结构造成明显的影响（图），但 和 的 暴露处理抑制了弓背青鳉卵母细胞的成熟，卵母细胞多停留在初级卵母细胞阶段（，）（图、）。暴露对雌性弓背青鳉成鱼基因转录水平的影响 在肝脏中，的 暴露可以显著上调卵黄蛋白原（，）和透明带蛋白前体（，）基因的转录水平，其中 和 的上调显著（），和 的上调极显著（），和 的上调不显著（）；和 的 暴露未对和 的表达造成显著影响（图）。在卵巢中，的 暴露显著上调了细胞色素 芳香化酶（）基因、细胞色素 介导侧链裂解酶（，）基因，另外 和 的 暴露极显著上调了 的转录水平（图）。讨论该研究在雌性弓背青鳉成鱼暴露过程中 的实测浓度与理论浓度基本一致，表明在 暴露时间内 的稳定性较高，这与其半衰期较长且难降解的特性相符，提示 对水生生物具有持久性危害。卷 期 黄泽胤等 环境相关浓度双酚 暴露对成年雌性弓背青鳉生长和生殖的毒性效应注：对照组；组；组；组；星号表示脂肪积累，箭头表示细胞间隙。：；，图 不同浓度 暴露处理后成年雌性弓背青鳉肝脏病理学特征 该研究中 暴露导致成年弓背青鳉雌鱼存活率显著下降。目前关于 对水生生物的致死浓度研究较少。等使用 的 对 月龄斑马鱼进行 暴露处理，结果发现试验组雌、雄斑马鱼的存活率与对照组相比没有显著差异；陈亚文研究发现用 的 处理成年斑马鱼 并未导致斑马鱼死亡；杨洋等研究发现 暴露 对斑马鱼胚胎致畸的半数效应浓度为 ，暴露 的半数致死浓度为 ；等研究了、和 对斑马鱼胚胎的半数致死浓度，分别为、和 。郭婧颖等通过毒性试验测得 对大型溞（）的 和 半数致死浓度分别为 和 。综合以上研究可推测出成年雌性弓背青鳉对水体中 的耐受程度较斑马鱼和大型溞等水生动物更低，水体中 会对弓背青鳉的生存造成威胁。肝脏在鱼类物质能量代谢、激素合成等生理过程中具有重要作用，是鱼类监测环境污染物毒性效应的主要靶点，也是动物或人体富集 的重要器官。该研究中短期 暴露导致雌性弓背青鳉成鱼肝脏细胞排列松散、肝细胞体积变大。类似的结果也出现在 和其他含氟类有机物的研究中，和 暴露组雄性斑马鱼中出现肝细胞排列松散，暴露组肝细胞明显肿大、形状不规则，但相同处理的雌性斑马鱼肝脏并未发生明显改变；全氟十二烷酸腹腔注射斑马鱼，短时间即导致斑马鱼出现肝损伤，包括肝细胞肿胀、空泡化和核固缩等；全氟辛烷磺酸暴露处理雌性大鼠后，导致幼鼠肝细胞肿大。因此，雌性弓背青鳉成鱼肝脏在组织学上可作为监测水体中 等含氟类化合物的靶点，显著的肝脏病理学损伤可能是 处理组弓背青鳉成鱼死亡率高的诱因之一。另外，成年雌鱼肝脏是卵黄蛋白原（，）、透明带蛋白前体（，）等基因的主要表达器官。这些基因对环境中雌激素类物质敏感，在无外界因素刺激的情况下仅在雌鱼肝脏中转录，在雄鱼及幼鱼中不发生转录，而当水环境中存在雌激素类物质时则诱导这些基因的大量表达。该研究中 诱导、和 的转录水平显著上升，和 的转录水平也明显上调。该结果符合 具有雌激素效应的特性，类似的结果在 暴露处理的雌性斑马鱼肝脏中也有发现；等研究表明 显著提高了斑马鱼胚胎中 的 水平。综合 对弓背青鳉肝脏组织病理学特征和基因转录水平的影响，推断 对雌性弓背青鳉成鱼既有雌激素效应又有肝脏毒性效应。安徽农业科学 年注：对照组；组；组；组。代表初级卵母细胞；代表皮质肺泡卵母细胞；代表早期卵黄卵母细胞；代表晚期卵黄卵母细胞 成熟卵母细胞。：；图 不同处理组成年雌性弓背青鳉卵巢病理学特征 注：表示与对照组差异显著（）；表示与对照组差异极显著（）。：（）；（）图 暴露对成年雌性弓背青鳉肝脏（）和卵巢（）中部分繁殖相关基因转录水平的影响 （）（）卷 期 黄泽胤等 环境相关浓度双酚 暴露对成年雌性弓背青鳉生长和生殖的毒性效应 和 暴露阻滞了雌性弓背青鳉成鱼卵母细胞的发育，这与以前的研究结果相一致。等研究发现 短期暴露（和 暴露）导致雌性斑马鱼卵母细胞发育阻滞；陈亚文研究表明经 处理的斑马鱼卵巢中卵母细胞发育受到抑制，其成熟卵母细胞数量较对照组显著减少；急性暴露还可能导致性成熟雌性小鼠性腺形态异常和卵巢未分化的导管末端小叶增生。因此，水体中环境相关浓度的 对雌性弓背青鳉成鱼具有较强的生殖毒性。该研究中 暴露改变了雌性弓背青鳉成鱼卵巢中、和 的转录水平。在性激素合成过程中，是已知的唯一催化胆固醇向孕烯醇酮转化的酶，后者是所有类固醇激素的共同前体。编码的性腺芳香化酶可将雄激素转化为雌激素，从而促进卵巢分化。该研究中 暴露上调了雌性弓背青鳉成鱼卵巢中 和 的转录水平。性腺体细胞衍生因子（，）属于 超家族成员，主要参与鱼类性别分化，对于维持鱼类精原细胞的正常增殖发育具有重要作用；敲除罗非鱼的 导致遗传雄鱼性逆转为雌鱼，而过表达 致使遗传雌鱼的性腺发育为精巢。该研究中 和 暴露显著上调了雌性弓背青鳉成鱼卵巢 转录水平，这可能抑制了卵巢的成熟。据此推测 对雌性弓背青鳉成鱼的生殖毒性可能与 改变了繁殖相关基因的转录水平有关。结论该研究结果表明，水体中环境相关浓度的 暴露对雌性弓背青鳉成鱼的生存和生长造成了不利影响。暴露还导致雌性弓背青鳉成鱼肝损伤，上调了肝脏中 和 转录水平，导致了卵巢结构异常，阻碍了卵母细胞的成熟，影响了卵巢中、和 的转录水平。作为一种新型的内分泌干扰化合物，致毒机理及其对水生生物的危害需要引起更多的关注。参考文献 ，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：宋作栋，仇雁翎，张华，等水体中双酚类物质的赋存现状及研究进展环境化学，（）：，：，（）：，（）：，：，：，：，（）：，：，：，（）：，（），（）：，：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：陈亚文六氟双酚 暴露对成鱼期斑马鱼的毒性效应海口：海南大学，唐天乐六氟双酚 对斑马鱼（）甲状腺轴及认知能力的干扰效应研究海口：海南大学，杨洋双酚 暴露对胚胎 幼鱼期斑马鱼的毒性效应及甲状腺内分泌系统的干扰效应海口：海南大学，吴迪双酚 对小鼠血睾屏障和精子发生的影响及其机制研究武汉：华中农业大学，（）：安徽农业科学 年 黄乾生，陈亚檞，方超，等盐度影响全氟辛烷磺酸对海水青鳉（）的毒性科学通报，（）：杨洋，陈亚文，唐天乐，等双酚 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