褐藻寡糖结合低磁场冷冻对鲢...原纤维蛋白结构和性质的影响_丛海花.pdf

DOI:10.12131/20220245文章编号：2095 0780（2023）03 0110 09褐藻寡糖结合低磁场冷冻对鲢肌原纤维蛋白结构和性质的影响丛海花1，逯晓燕2,3，周 倩2，张紫薇2，郑志红2，刘 丽4，宋关梁2，雷惠雯2，陈继伟11.苏州农业职业技术学院 食品科技学院，江苏 苏州 2150082.大连海洋大学 食品科学与工程学院/辽宁省水产品加工及综合利用重点实验室，辽宁 大连 1160233.中科荣耀(苏州)生物科技有限公司，江苏 苏州 2151524.西北农林科技大学 机械与电子工程学院，陕西 杨凌 712100摘要：为使以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)为原料的水产预制菜在加工过程中获得良好的保鲜品质，探索了一种新的冷冻方法。研究了0.6%(w)褐藻寡糖结合2 mT低磁场冷冻对鲢肌原纤维蛋白结构及功能的影响，以20 下无处理为空白组，在此基础上分别加入褐藻寡糖、褐藻寡糖+低磁场作为实验组，并在30 下添加褐藻寡糖作为常规冷冻组，同期冷冻鲢肌原纤维蛋白共28 d。通过测定溶解度、浊度、表面疏水性、巯基含量、热稳定性、傅里叶变换红外光谱以及内源性荧光光谱，综合比较冷冻后肌原纤维蛋白的结构和性质。结果表明：20 下的3种冷冻方式之间浊度无显著性差异；常规冷冻组蛋白质溶解度较高(94.11%)；经褐藻寡糖+低磁场处理后，减少了疏水基团的暴露，表现出较高的总巯基质量摩尔浓度(15 mmolkg1)，并能减少色氨酸残基的暴露，有效保护蛋白质的三级结构；傅里叶变换红外光谱显示褐藻寡糖修饰后肌原纤维蛋白变性程度最低，-螺旋含量较高，二级结构更加稳定。研究表明，0.6%(w)褐藻寡糖协同低磁场处理可更好地维持鲢肌原纤维蛋白的稳定性，这为褐藻寡糖在冷冻水产品中的应用奠定了基础，并可为进一步研究低磁场冷冻提供参考。关键词：鲢肌原纤维蛋白；褐藻寡糖；低磁场；冷冻中图分类号：TS 254.4文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Effect of alginate oligosaccharides combined with low magnetic field freez-ing on structure and properties of myofibrillar protein of silver carpCONG Haihua1,LU Xiaoyan2,3,ZHOU Qian2,ZHANG Ziwei2,ZHENG Zhihong2,LIU Li4,SONG Guanliang2,LEI Huiwen2,CHEN Jiwei11.College of Food Science and Technology,Suzhou Polytechnic Institute of Agriculture,Suzhou 215008,China2.College of Food Science and Engineering,Dalian Ocean University/Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Utilization ofLiaoning Province,Dalian 116023,China3.Zhongke Runyao(Suzhou)Biotechnology Co.,Ltd.,Suzhou 215152,China4.College of Mechanical and Electronic Engineering,Northwest A&F University,Yangling 712100,ChinaAbstract:In order to obtain good preservation quality in the processing of aquatic pre-made products with silver carp(Hypo-phthalmichthys molitrix)as raw material,we designed a new freezing method.We investigated the structural and functionalchanges of myofibrillar protein(MP)by freezing alginate oligosaccharides(AO)at a mass fraction of 0.6%with a low magnetic第 19 卷第 3 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.32023 年 6 月South China Fisheries ScienceJun.，2023收稿日期：2022-09-14；修回日期：2022-11-03基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目(31701630)；辽宁省教育厅 2021 年度高等学校基本科研项目(LJKZ0715)；2022 年青年教师科研能力提升计划(BS202218)作者简介：丛海花(1983)，女，副教授，博士，研究方向为水产品加工。E-mail:field(LMF)of 2 mT,and used no treatment at 20 as the blank group.On this basis,we added AO and AO+LMF as the ex-perimental group,added AO as the common freezing(CF)group at 30,and had frozen the MP for 28 d.By measuring thesolubility,turbidity,surface hydrophobicity,sulfhydryl content,thermal stability,Fourier transform infrared spectroscopy andendogenous fluorescence spectroscopy,we comprehensively compared the structure and properties of frozen MP.The resultsshow that there were no significant differences in the turbidity among the three freezing methods at 20.The protein solubili-ty of CF group was 94.11%.After AO+LMF treatment,the exposure of hydrophobic groups reduced,with a higher total sulfhy-dryl content of 15 mmolkg1,and the exposure of tryptophan residues reduced,which protected its protein tertiary structure ef-fectively.Fourier transform infrared spectroscopy shows that after AO modification and freezing,MP denaturation was the low-est,-helix content was higher,and secondary structure was more stable.It it showed that 0.6%fucoidan with low magnetic fieldfreezing treatment can better maintain the stability of MP in silver carp,which lays the foundation for the application of AO infrozen aquatic products and provides references for the further research on the low magnetic field freezing.Keywords:Silver carp myofibrillar protein;Alginate oligosaccharides;Low magnetic field;Freezing鲢(Hypophthalmichthys molitrix)是中国主要的养殖型淡水鱼类，其肉质鲜美、营养丰富，是鱼糜加工的主要原料之一。冷冻贮藏是鱼糜制品保存的主要方法，肌原纤维蛋白(Myofibrillar protein,MP)是鱼肉中重要的蛋白质，然而，由于长时间的冷冻贮藏，鱼糜制品中冰晶的生长会引起肌原纤维蛋白变性1，从而影响其品质。因此，探索新型的冷冻方式来减弱肌原纤维蛋白变性程度，保持良好的鱼糜品质显得尤为重要。磁场对食品材料具有高穿透性，且与食品无接触2，是一种新型的非热物理加工技术。磁场会使食品中水分子之间的键联更紧密，形成的网络更稳定，从而达到冰点冻结，并在冻结过程中形成大小均匀的冰晶，以保护产品的品质属性3。褐藻寡糖(Alginate oligosaccharide,AO)是经褐藻胶降解产生，由-D 甘露糖醛酸(ManA)和C-5 差向异构体-L 古洛糖醛(GulA)通过 1-4 糖苷键连接而成4。有研究报道，褐藻寡糖可以阻碍冰晶的生成，并且有良好的抗菌、抗氧化能力5，可作为天然绿色的抗冻剂。褐藻寡糖可以降低贮藏期间猕猴桃(Actinidia chinensis)灰霉病的发生率和病斑直径，并能使其保持更高的硬度和更低的可溶性固形物含量6；在凡纳滨对虾(Litopenaeus van-namei)的冷冻中，褐藻寡糖可以延缓蛋白质变性，显著提高虾的保水能力，并保持良好的品质7；也有研究发现，褐藻寡糖可以降低冷冻鱿鱼鱼糜肌肉组织的硬度，提升色泽和弹性8。但目前仍缺乏褐藻寡糖对磁场冷冻过程中产品保鲜的相关报道。低磁场(Low magnetic field,LMF)冷冻作为新型技术，已逐渐应用于食品冷冻保鲜领域。在鲤(Cyprinus carpio)冷冻中，低磁场缩短了相变阶段的时间，延长了冻结阶段的时间9；在牛肉保鲜上，低磁场可使牛肉的保质期延长 6 d 以上，同时可以防止结晶10；在樱桃(Cerasus pseudocerasus)冷冻中，低磁场可一定程度上减少其滴水损失11。使用低磁场冷冻技术和抗冻剂均能减弱冷冻贮藏过程中食品蛋白质的变化，并使其保持良好的品质。目前有关天然、绿色来源抗冻剂的协同增效作用研究报道仍较少。因此，本研究选择褐藻寡糖协同低磁场技术的冷冻方式，通过测定无处理冷冻、褐藻寡糖修饰冷冻、褐藻寡糖协同低磁场冷冻和常规冷冻下鲢肌原纤维蛋白的浊度、表面疏水性、巯基含量等指标，探讨了褐藻寡糖结合低磁场冷冻技术对鲢肌原纤维蛋白结构及功能的影响，以期为抗冻剂与低磁场技术在水产品冷冻和保鲜中的应用提供理论依据，并为获得良好的保鲜品质提供新思路。1 材料与方法 1.1 材料鲜活鲢体质量约 1.5 kg，购买于辽宁省大连市熟食品交易中心。褐藻寡糖由中国科学院过程工程研究所苏州产业基地中科荣耀(苏州)生物科技有限公司提供，相对分子质量为 4001 500 D，聚合度为 37。试剂：氯化钠(NaCl)(辽宁泉瑞试剂有限公司)；氢氧化钠(NaOH)(天津市东丽区天大化学试剂厂)；乙醇(天津市北联精细化学品开发有限公司)；溴化钾(KBr)(光谱纯)天津市大茂化学试剂厂；三羟甲基氨基甲烷(Tris)(青岛捷世康生物科技有限公司)；其余试剂均为国产分析纯。第 3 期丛海花等:褐藻寡糖结合低磁场冷冻对鲢肌原纤维蛋白结构和性质的影响111仪器与设备：MFl-F1 磁场冷冻冷藏箱 英都斯特(无锡)感应科技有限公司；TD5A-WS 立式高速冷冻离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)；Syn-ergyH1/H1M 酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；F-2700 荧光分光光度计(日本 Hitachi 公司)；Q20 差示扫描量热仪(美国 TA 仪器公司)；NEXUS670 红外光谱仪(美国 PerkinElmer 公司)；Scientz-30D 真空冷冻干燥机(宁波新芝生物科技股份有限公司)。1.2 方法1.2.1鲢肌原纤维蛋白的提取根据 Park 等12的方法，略作修改。取鲢背部白肉，加入 4 倍体积 10 mmolL1 Tris-HCl(pH 7.2)缓冲液(4)，高速均质 15 s，在 5 000 rmin1下离心 15 min，然后在沉淀中加入 4 倍体积 10mmolL1 Tris-HCl 缓冲液(0.6 molL1NaCl,pH 7.2,4)混匀后再均质 10 s，接着在 4 500 rmin1下再次离心 20 min，保留上清液。以牛血清蛋白作为标准品制作标准曲线。将溶液与双缩脲试剂按体积比 14 混匀，静置 30 min 后于 540 nm 测量吸光度，计算蛋白质的质量浓度。1.2.2冷冻条件及样品处理将提取的肌原纤维蛋白与 0.6%(w)褐藻寡糖混合置于 MFl-F1 磁场冷冻冷藏箱采用 2 和 0 mT低磁场结合20 冷冻，以海尔 BCD-336WD-PC 冷藏箱30 的常规冷冻组作为阳性对照组，以无添加褐藻寡糖的 0 mT 磁场20 冷冻为空白组(B)，冷冻周期为 28 d。在测定各项指标之前，样品在 4 下解冻过夜。1.2.3浊度的测定根据 Liu 等13的方法，略作修改。调整肌原纤维蛋白溶液质量浓度为 1 mgmL1，混匀后静置20 min 于 340 nm 处测定吸光度(A340 nm)以表示其浊度。每个样品重复 3 次。1.2.4溶解度的测定根据 Joo 等14的方法，略作修改。将肌原纤维蛋白溶液调整至 5 mgmL1，取 0.5 mL 蛋白质溶液，加入 2 mL 双缩脲试剂于 4 静置 30 min 后在540 nm 下检测其吸光度；另取 1 mL 溶液，在5 500 rmin1下离心 15 min，取上清液 0.5 mL，其余操作步骤与离心前相同，得到离心前后溶液的吸光度。计算出对应的浓度。具体按如下公式计算：So=C0C1100%(1)式中：So为溶解度；C0为离心后上清液肌原纤维蛋白质量浓度；C1为离心前肌原纤维蛋白质量浓度。1.2.5表面疏水性的测定根据 Riebroya 等15的方法，略作修改。准备质量浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mgmL1的肌原纤维蛋白溶液各 2 mL，然后分别加入 10 L 8-苯胺基-1-萘磺酸钠（8-Aniline-1-naphthalenesulfonicacid sodium,ANS）(10 mmolL1 ANS,20 mmolL1Tris,pH 7.5)充分混匀，于 4 静置避光冷藏 10min。使用酶标仪进行检测。参数设置：激发波长375 nm，发射波长 485 nm，增益 50。以荧光强度为纵坐标，肌原纤维蛋白各浓度为横坐标作图，以曲线斜率表示蛋白质表面疏水性系数 So-ANS。1.2.6巯基的测定根据 Liu 等16的方法，略作修改。调整肌原纤维蛋白溶液质量浓度至 5 mgmL1，取 0.5 mL 溶液，加入 4.5 mL Tris-HCl 0.2 molL1，pH 6.8，8 mol 尿素，2%(w)SDS，10 mmolL1 EDTA 缓冲液，取 4 mL 混合液，加入 0.25 mL DTNB 溶液，40 水浴 25 min，在 412 nm 下测吸光度。活性巯基的测定是将 4.5 mL 缓冲液(Tris-HCl 0.2molL1,pH 6.8,10 mmolL1 EDTA)加入 0.25 mLDTNB 溶液，混合后在 4 下反应 1 h 于 412 nm下测吸光度。按如下公式计算巯基质量摩尔浓度。每个样品重复 3 次。bSH=106AD13 600C(2)式中：bSH为巯基质量摩尔浓度(mmolkg1)；A 为除去空白试剂后样品于 412 nm 处吸光度；D 为稀释倍数；C 为蛋白质质量浓度(mgmL1)。1.2.7热稳定性的测定根据 Dergez 等17的方法，略作修改。取鲢肌原纤维蛋白溶液 12.018.0 mg，均匀地铺在液体铝制坩埚中，压盖密封，进行扫描。以空坩埚为空白，升温速率 10 min1，温度扫描范围 4080。每个样品重复 3 次。1.2.8傅里叶变换红外光谱的测定根据 Xiong 等18的方法，略作修改。将 3.0 mL肌原纤维蛋白冷冻干燥，取冻干后的样品中。在约 18 MPa 的压力下加压 2 min，释放压力后取出样品进行扫描得到傅里叶变换红外光谱。1.2.9内源性荧光光谱的测定内源性荧光强度通过荧光分光光度计进行测112南 方 水 产 科 学第 19 卷定。根据 Chelh 等19的方法，略作修改。调整肌原纤维蛋白溶液质量浓度为 1 mgmL1，设置激发波长为 280 nm，扫描范围 300450 nm。每个样品重复 3 次。1.3 数据处理XSD采用 Excel 2021 软件处理数据和绘图。使用SPSS 26.0 软件对数据进行单因素方差分析，通过Duncans 法进行多重比较，当 P0.05)。与褐藻寡糖组相比，褐藻寡糖+低磁场组的浊度降低，但不显著(P0.05)。说明此方法可抑制肌原纤维蛋白聚集，但其效果并不显著。30 下冷冻的常规冷冻组，其浊度显著高于20 下冷冻的褐藻寡糖组(P0.05)。从整体上看，20 下 3 种冷冻方式之间浊度无显著性差异。2.2 溶解度蛋白质溶解度与多个理化性质相关，如起泡、乳化和凝胶等。溶解度的增加，可以增强肌原纤维蛋白凝胶强度21。不同冷冻方式对肌原纤维蛋白溶解度的影响见图 1，4 个组的肌原纤维蛋白溶解度分别为 89.85%、91.78%、91.23%和 94.11%。空白组的溶解度最低，与褐藻寡糖组相比，溶解度下降了 1.38%，差异显著(P0.05)。在不同低温下冷冻，30 下的常规冷冻组与20 的褐藻寡糖组相比，溶解度高出了 2.88%，差异显著(P0.05)。总体上，20 条件下，经 0.6%(w)的褐藻寡糖修饰冷冻后，会提高肌原纤维蛋白的溶解度；在此条件下，增加低磁场后，二者协同也明显提高了肌原纤维蛋白的溶解度。而在30 条件下，鲢肌原纤维蛋白的溶解度更高，更能保持其理化性质。2.3 表面疏水性表面疏水性可以反映蛋白质的变性程度，也是凝胶网络形成的主要结合力，表面疏水性的降低，不利于肌原纤维蛋白凝胶的形成22。不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的表面疏水性见图 1。褐藻寡糖组的表面疏水性显著低于空白组(P0.05)。褐藻寡糖+低磁场组的表面疏水性比褐藻寡糖组低 127.34，差异显著(P0.05)。与褐藻寡糖组相比，常规冷冻组的表面疏水性显著降低(P0.05)，说明在褐藻寡糖的修饰冷冻下，可降低肌原纤维蛋白疏水基团的暴露，抑制蛋白变性，降低温度会增加抑制作用。褐藻寡糖+低磁场组的肌原纤维蛋白表面疏水性相对最低，表明双重作用下，可更好地抑制肌原纤维蛋白变性。cbba0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 溶解度 Solubility/%bbba0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 浊度 Aabdc0100200300400500600BAOAO+LMFCF表面疏水性 So-ANS组别 GroupB.空白组；AO.褐藻寡藻；AO+LFM.褐藻寡糖+低磁场；CF.常规冷冻。后图同此。CF.Common freezing.340 nm图1 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的浊度、溶解度和表面疏水性注：相同颜色方柱上不同字母表示组间存在显著差异(P0.05)；图 2 同此。Fig.1 Turbidity,solubility and surface hydrophobicity of myofibrillar protein with different freezing methodsNote:Different letters on the same color bars indicate significant differences among the groups(P0.05).The same case in Fig.2.第 3 期丛海花等:褐藻寡糖结合低磁场冷冻对鲢肌原纤维蛋白结构和性质的影响113 2.4 巯基巯基对于维护肌原纤维蛋白空间结构的稳定性有重大意义，其中活性巯基易被氧化生成二硫键，而二硫键的形成是导致肌原纤维蛋白发生变化的主要原因。有研究显示，总巯基含量降低会导致肌原纤维蛋白凝胶的持水力下降23。不同冷冻方式下鲢肌原纤维蛋白巯基和二硫键的质量摩尔浓度如图 2 所示。褐藻寡糖组总巯基的浓度显著低于空白组(P0.05)，但活性巯基和二硫键的浓度变化较小。褐藻寡糖+低磁场双重作用下，肌原纤维蛋白的总巯基和活性巯基的浓度显著高于褐藻寡糖组(P0.05)。另外，与褐藻寡糖组相比，常规冷冻组的总巯基和活性巯基的浓度上升，二硫键浓度显著下降(P0.05)。而褐藻寡糖+低磁场组的肌原纤维蛋白T 比褐藻寡糖组高出 14 左右(P0.05)。说明在褐藻寡糖修饰冷冻下，对肌原纤维蛋白的热稳定性温度无显著性影响，但加入低磁场后，肌原纤维蛋白的热稳定性温度出现明显提升，说明二者协同能显著提高肌原纤维蛋白的热稳定性温度，减少肌原纤维蛋白变性。此外，空白组的H 比褐藻寡糖组有小幅度升高，但无显著性变化(P0.05)，表明褐藻寡糖修饰冷冻对变性焓值影响不大。不同冷冻条件下褐藻寡糖组、褐藻寡糖+低磁场组和常规冷冻组之间的 H 无显著变化(P0.05)，表明在这 3 种冷冻条件下，鲢肌原纤维蛋白变性时需要的焓值基本相似。2.6 傅里叶变换红外光谱傅里叶变换红外光谱能够利用分子中有振动模式的化学键来研究分子的结构，在测定蛋白质二级结构中发挥重要作用。在鱼糜凝胶特性的研究中，-螺旋含量降低和-折叠含量增加均有利于蛋白质变性和凝胶形成25。图 3 显示肌原纤维蛋白在红外图谱上有多个吸收波段，蛋白质二级结构包括-螺旋、-折叠、-转角和无规卷曲，蛋白质二级结构的特征峰(酰胺 I 带)分别位于 1 6501 658 cm1、1 6651 680 cm1和 1 6601 665 cm1附近26。表 2 为不同冷冻方式下蛋白质二级结构含量。有研究报道，蛋白质的结构特征与-折叠、-转角和无规卷曲的比例呈正相关，但与-螺旋部分呈负相关27。褐藻寡糖组对比空白组，-螺旋含量略有增加(P0.05)；褐藻寡糖+低磁场组相比于褐藻寡糖组，-螺旋含量显著下降(P0.05)。与褐藻寡糖组相比，常规冷冻组的-螺旋含量降低(P0.05)。总的来说，采用褐藻寡糖修饰冷冻能减少鲢肌原纤维蛋白-螺旋的损失，有助于抑制水溶性蛋白质和疏水残留物的暴露。2.7 内源性荧光光谱蛋白质中色氨酸等芳香族氨基酸残基是天然发表1 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的热变性温度与焓值Table 1 Thermal denaturation temperature and enthal-py of myofibrillar protein with different freezing methods组别GroupT/H/(Jkg1)空白组 Blank group55.240.97b6.52.8a褐藻寡糖 AO52.423.64bc3.72.7ab褐藻寡糖+低磁场 AO+LFM69.242.46a2.31.2b常规冷冻 CF49.842.29c1.60.2b注：不同字母表示不同处理间差异显著(P0.05)；后表同此。Note:Different letters indicate significant differences(P0.05)。褐藻寡糖+低磁场组的最大荧光强度值低于褐藻寡糖组，也无统计学意义(P0.05)。常规冷冻组的最大荧光强度值显著高于其他组(P0.05)。总体来说，褐藻寡糖协同低磁场冷冻处理对减少蛋白质中色氨酸残基的暴露和蛋白质展开变性具有良好的效果。3 讨论冷冻是常用食品保存方法之一，冷冻过程中形成的冰晶大小、形态及冷冻加工参数和原料条件等均会对产品的最终品质产生一定影响28，如蛋白质变性、汁液流失等，而蛋白质变性程度是维持食品品质的重要参数。目前保护蛋白质免受外力损伤并延缓其变性的方法主要有 2 种：添加抗冻剂(糖类化合物和抗冻蛋白等)和采用冷冻技术。笔者团队前期的研究发现，低磁场冷冻技术对鲢肌原纤维蛋白具有良好的保护作用29；也有研究表明褐藻寡糖可以防止肌原纤维蛋白的结构免受冰晶破坏，维持良好的蛋白质结构稳定性30。3.1 冷冻温度对肌原纤维蛋白结构和性质的影响冷冻温度是影响冻结和冰晶形成的重要因素之表2 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的二级结构变化Table 2 Change in secondary structure of myofibrillar protein with different freezing methods%组别Group-螺旋-helix-折叠-sheet-转角-turn无规卷曲Random coil空白组 Blank group21.780.03ab23.540.08a35.140.05a19.540.00a褐藻寡糖 AO31.650.06a28.120.14a30.880.08a9.350.16a褐藻寡糖+低磁场 AO+LFM13.900.12b29.630.05a34.040.03a22.430.07a常规冷冻 CF23.850.02ab31.370.08a33.050.01a11.730.10a8001 6002 4003 2004 000波长 Wavelength/cm1 BAOAO+LMFCF1 6541 6521 6551 650图3 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白的红外光谱图Fig.3 Fourier transform infrared spectra of myofibrillarprotein with different freezing methods180190200210220230240(a)294296298300302 荧光强度 Fluorescence intensity 波长 Wavelength/nmBAOAO+LMFCFbbba050100150200250(b)BAOAO+LMFCF最大荧光强度值Maximum fluorescence intensity value组别 Group图4 不同冷冻方式下肌原纤维蛋白内源性荧光光谱(a)和最大荧光强度(b)注：方柱上不同字母表示组间存在显著性差异(P0.05)。Fig.4 Endogenous fluorescence spectra(a)and maximum fluorescence intensity(b)ofmyofibrillar protein with different freezing methodsNote:Different letters on the bars indicate significant differences among the groups(P0.05).第 3 期丛海花等:褐藻寡糖结合低磁场冷冻对鲢肌原纤维蛋白结构和性质的影响115一，而冷冻贮存期间的温度波动往往会加速产品中的冰再结晶，导致较大的冰晶形成，加大了产品的机械损伤31。在20 和30 低温冷冻的情况下，产生的冰晶大小、形态不同，常规冷冻组(30)下产生的冰晶破坏蛋白质结构的能力更强32，加速了蛋白质的聚集变性；此外，冰晶间的挤压和分子间相互作用，使肌原纤维蛋白构象发生变化33，导致其二硫键发生弱化和断裂34；在肌原纤维蛋白三级结构方面，降低温度后，冰晶导致肌原纤维蛋白结构的解折叠，在冷冻贮藏过程中减少了网状蛋白质的聚集，增加了色氨酸的暴露35。本研究中传统常规冷冻(30)下，加速了蛋白质的聚集，使得肌原纤维蛋白的二级结构变得松散、不稳定，这与浊度和二级结构的含量变化结果一致。3.2 褐藻寡糖对肌原纤维蛋白结构和性质的影响糖类抗冻剂可以促进自由水向结合水转化，有效抑制冰晶生成，也可以取代蛋白质分子表面的结合水与之结合，从而抑致蛋白质变性。研究发现，褐藻寡糖可以通过氢键、疏水相互作用或静电相互作用嵌入冰层，抑制冰晶的生长36，防止肌原纤维蛋白的结构受到冰晶的破坏；褐藻寡糖也可通过作用力与冰晶结合，从空间上影响蛋白质的分布30。本研究中添加褐藻寡糖后，其肌原纤维蛋白的溶解度显著升高(P0.05)，褐藻寡糖组活性巯基和二硫键的含量无显著变化。薛勇等37用 10%(w)的海藻糖溶液处理鳙(Aristichthys nobilis)肌原纤维蛋白后，活性巯基和二硫键的含量均明显降低，推测其与褐藻寡糖的浓度相关，但具体原因还需验证。褐 藻 寡 糖 与 肌 原 纤 维 蛋 白 间 的 静 电 作用38可导致其-螺旋含量升高；Zhong 等39用0.21.6 mgmL1苹果多酚对羔羊(Agnus)肌原纤维蛋白处理后，所得结果与本研究相似。在肌原纤维蛋白三级结构方面，褐藻寡糖与肌原纤维蛋白聚合反应后，蛋白质天然排列改变，会暴露出色氨酸残基40，提升其荧光强度。本研究使用 0.6%(w)的褐藻寡糖维持了肌原纤维蛋白二级结构的稳定，在溶解度、表面疏水性等方面有较好表现，使用褐藻寡糖作为抗冻剂，在成本上具有优势。3.3 低磁场对肌原纤维蛋白结构和性质的影响磁场可能通过干扰氢键减小冰晶成核的临界半径和临界功，提高均相成核率41，从而抑制冰晶的生长；也可能使得水分子重新排列，在冷冻过程中形成细小、均匀、光滑的冰晶，保护细胞免受破坏2。研究表明，低磁场冷冻产生的自由基可诱导蛋白质构象变化，影响蛋白质结构和功能特性42。本研究中，在褐藻寡糖的存在下，使用低磁场冷冻技术使得肌原纤维蛋白表面疏水性显著降低，总巯基含量和热变性温度显著升高，这与低磁场通过折叠、再交联和聚集来修饰蛋白质结构43和肌原纤维蛋白的总巯基和游离氨基以及-转角和-折叠结构的总含量增加相关44，有效维持了肌原纤维蛋白的三级结构构象。然而 0.6%(w)的褐藻寡糖协同低磁场冷冻处理导致肌原纤维蛋白二级结构变的不稳定、松散，其作用机制还需进一步探讨。4 结论本研究结果表明，与空白组相比，褐藻寡糖组、褐藻寡糖+低磁场组和常规冷冻组均维持了肌原纤维蛋白良好的溶解性并抑制了疏水基团的暴露；0.6%(w)褐藻寡糖组的-螺旋与-折叠的总含量为 59.77%，说明其对肌原纤维蛋白的二级结构有一定的保护作用；褐藻寡糖+低磁场组的最大荧光强度降低了 3.6%，显著抑制了肌原纤维蛋白中色氨酸残基的暴露，总巯基的浓度最大(1.5mmolkg1)，维持了肌原纤维蛋白良好的三级结构构 象；常 规 冷 冻 组 的 热 变 性 温 度 显 著 降 低(P0.05)，最大荧光强度为 235.33，显著升高(P0.05)，表明常规冷冻处理可使肌原纤维蛋白三级结构构象改变。总的来说，0.6%(w)褐藻寡糖协同低磁场冷冻对肌原纤维蛋白三级结构的保护具有积极作用，在维持二级结构稳定性方面有优势，也说明在褐藻寡糖的存在下，低磁场冷冻比常规冷冻更适合肌原纤维蛋白冷冻，可以降低能源损耗。探索低磁场冷冻工艺中，针对不同的原料，褐藻寡糖的最适添加量以及合适的磁场强度将成为下一步的研究方向，褐藻寡糖协同低磁场冷冻对肌原纤维蛋白中抑制冰晶生长的机理，还需进一步深入探索；同时冷冻方案对冷冻鱼糜、冷冻鱼肉的研究，将进一步验证褐藻寡糖协同低磁场冷冻方案的优势，有助于解决制约冷冻加工业发展的能耗大、产品品质下降的瓶颈问题。参考文献：LEE S,JO K,JEONG H G,et al.Freezing-induced denaturation of1116南 方 水 产 科 学第 19 卷myofibrillar proteins in frozen meatJ.Crit Rev Food Sci,2022:2116557.DOI:10.1080/10408398.2022.2116557.ZHOU H L,JIN Y M,HONG T T,et al.Effect of static magneticfield on the quality of frozen bread doughJ.LWT,2022,154:112670.2袁琳娜,李洪军,王兆明,等.新型冷冻和解冻技术在肉类食品中的应用研究进展 J.食品与发酵工业,2019,45(2):220-227.3BI D C,YANG X,LU J,et al.Preparation and potential 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