DB61∕T 412-2007 食品中甘油的测定—酶法(陕西省).pdf

DB61 陕两省地万标:住DB们IT412-2007 食品中甘油的测定酶法200709-03发布200709但实施陕西省质量技术监督局发布IJ 本标准中的附录A为资料性附录。本标准由中华人民共和国陕西出入境检验栓度局提出并归口。本标准起直在单位:中华人民共和国陕西出入境检验检疫局。本辑推起草人t欧阳宏、蒋宏伟、陈茂盛、张春山。本标准系首次发布。DB61rr 4122007 DB61rr 412-2007 食品中甘油的测定一一酶法范自本标准现定了剧酶法测定食品中甘泊的含最。本际准适用于食品中甘榻的W定。摆范性亏i用文件.Fflj文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注目期的引周文件，其随后所有的结改单不包括勘误的内容浅修订版均不远!书于本际准，然雨，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使周这些文件的最新版本e凡是不注曰期的引用文件，其最新摄本边用于本标准。IFU 77 (2001)一一一葡萄什中甘捕的测定EBC 9.33一一啤酒中甘油的黯定(酶法2 术语和忘义3. 1 本栋准中JifT指食品包括:萄酒、穰萄汁、醋、蜂蜜、酒精、果酒等3.2 捋号与缩略i吾GK 甘油激隅ATP 二磷毗甘酸鼠ADP 散背二锅酸PK 丙翻酸激酶PEP 磷最烯醇式丙翻酸PEP-CHA 磷最烯醇式因醋酸单环乙饺盐L-LDH L乳酸酶脱氢酶NADH -烟碱咖踉喋岭核昔酸氨NAD 盘!碱黠I嚷岭二核苛酸U 自每活度国陈单位，在25C的标准条件卜每minlU的酶活动量转化成11lmol 的物展。吸光度值物质的浓度A C 3 原理甘袖在甘?由激酶的催化卜可敲Ap磷酸、化为3-磷酸甘油脂，ATP转化为ADP:4 .号34.iijel岖VM事ht量41孟薄F-毫也3咽，.、高溢，13siza-155海ili-f!11反应式J.l:GK GlyceroL + ATP 叫一一一.L-glycerol-3-phosphat+ADP 上式中形成的ADp:在闪酣酸激胞的催化卡.可LjPEP作Hn:生成Ap及丙翻酸醋:反问式为:DB611T 412-2007 PK ADP令PEP一一一一份AP + Pyruvate 丙翻酸睦在L-乳酸摇脱氧酶的作用下可被NADH还原为L乳酸甜，NADH被氧化为NAD;反应式为:L-LDH Pyruvate + NADH + H 一一-L翩lactate+ NAD 被氧化的NADH的摄取决于甘浊的主敌，NADH的暖光度值可在340nm下翻量。5试剂5. 1 苦氨酷甘莞酸5.2 NADH、ATP、5.3 MgS047日O25.4 丙酣酷爱;致酶5.5 L-乳酸酶院登在西每5.6 甘i串激酶景:孚物5. 7日Cl5.8 NaOH 5.9 KOH PEP-CHA 5. 10 亚性盖住御Fe(CN) 63日105. 11 疏酸特ZnS047日205.12 重蒸水5.13 也可使用商品试齐IJ盒6 设备6. 1 移液检(5mL、1mL、50唰200L、10-50L)6. 2 比色到1:先径l.Ocm6.3 紫外分光光度计，可变波长，在340nm;贯IJ;i:E6.4 折叠蜡纸，孔径10m6.5 蔑心机6. 6 离心智、烧杯、移液检配套j摇头、破瑭梅等7 检预IJ步骤7. 1 试赛IJD制7. 1. 1 甘鲸酸甘藏酸缓冲液:称0.66g甘氢歌甘氨最济丁90乱*中，J斗jNaOHi建;jipIH直至7.4，定学手至lOOmL7. 1. 2 辅黯及提;中渣的j昆和物:骂立11mLi宁主主酣，j:j氨般缓泞液，容解NADH扮7mg;ATP约22mg:PEP-c队的11mg;加入lmol儿的班gSO， 7日O4mL 2 DB61fT 412-2007 7.1.3 离醋慧、激辑、L裴攘攘段蘸捣盛j孚嗨t它主m时，lmL重蒸本溶解600U自黯般激梅子崭及550U L一乳酸撞段氢酷。7.1.4 苦?由激辈革悬浮费:肩1mL重蒸Jj(洛辑部口的甘浩激酶。HCl: 2 mollL 7.1.5 NaOH: 2mo万L7.1.6 Carrez澄清液Carrez溶液85mmo盯LCarrez-1榕液:称取3.60gK4Fe (CN) 6.3日20，加入100mL蒸馆水溶解。Carrez-II 容液250mmo1!L Carrez-II榕液t称取7.20gZNS04 7H20 ，加入100mL燕惯71:1二.固体样品，J持50mL最;二基本稀释济醉，主11入10mLCarrez壤洁攘，充分海匀，部后过法，可段去其中的提浊辑或色素，取法接培子拉溅。7.2.3.2 除弃样品中蛋白震m Carrez试剂可段去样品中的蛋白皮，25mL经过过滤的样品洛液，如入10mLCarrez 3000r/min离心10min，取法接南下检嚣。7.2.3.3 舔弃样品中器肪HJ热/主拉提25g样品中的脂肪(拮提温度需在插曲的洛解J!l之上)，冷却眉可分离出脂蹄，将余物旋转移至容量瓶中并加水歪50mL;J.洛15min雨后过滤，热水抽提启用10mLCarrez溶液晴、清、过滤，取津、液用于捡草药。检漠1步穰(接司是1进行)7.3. 1 设空白对照:耳又比色血，依次加入1.000mL辅酶泪和物、2.00OmL豆蒸水，以010mL丙酣酸撒酶、L-乳酸醋脱氮酶i棋?孚物，混合提6min启读取吸光度值(A1)，然后加入0.010mL甘油撒酶悬浮物，特1届反应(大约5-10min)，立即读取吸光度值(A2)，空白吸光度值差(Al-Az)。7.3.2样晶:取比位l1ll，依次加入1.00臼nL辆酶I凶手11物、0.100mL样品溶液、1.900mL重蒸水，0.010 mL肉眼酸撒酶、L乳酸酣脱氧酣悬浮物，1!i合宣6min日读瑕吸光度虽CA1)，然后加入0.010mL甘油激酶悬浮物，f守视台反问完成(大的510min)，立即读取破光度Ir(A2)，样品吸光度m美(A1-A2)作1140分别削样fH1id空内的吸光f支在差，甜JFiJij样品较光f主直差减去空白眼光度f主芹:吁以f寻到公式门:7.2.2 3 7.2.3 7.2. :3. 1 7.3 音量iv;1也变革，委a事Ttsfd窑撞，号:aagjif-ijei-Ea军41品19rzkDB61厅412-2007!:.A= (AJ-A2) 问(AJ-A2)空白. . . .(1) 最后的眼光度蜜差应大于O.100，方能得到最精确的结果。如果眼光度f直是在!:.A在334及340nmF翻得的道离子1.0或在365nm下蹦得的远离子0.500，如此则表明样品落搜中甘油的浓度较高。琴是1检测程序加入比色嚣的溶液击对题样品栓黯, 辑黯澳和物1. 000 1. 000 样品溶液O. 100 重蒸71而后如入下列物质:甘?告激酶悬怦物0.010 。.010混和，等反应进行完全后钓510min)，立即读取样品扣空白的吸光度值A2如果在15min脂反应尚未停止，则在2min的问隅内继续读取读数，应至此直不再变化。8 计算C C C扩眉4 提器公式(2)计算法度:VjXMW t XdXVX1000 甘浩含量计算道德如F公式3.020X92.1 eX 1.00 XO.100 X 1000 2.781 XL1AXf X .AX f. a . .(2) X L1AX f 当分析固体或.f尘器体时，测盘前需称一定重量配常j样品洛液，其结果需按公式(3)计算C柑(g/L样dZ算是芳JX 100 (g/100g) .(3) If ttlll! (在样dzgJ贺tp)被检样品中甘油含盘在lllg至4011g之间。DB61厅412-20079 9. 1 9.2 为了得如一个足够的吸先搜最差，样品攘攘的故度最好梅释在台.04g/L式中:C 要捡蝇物质的浓度g甘袖/L样品榕搜MW 节浩摩右之质量92.1g/mol V1 比色皿中翻过洛攘的总体积，单位是mLV2 由试样制各的样品溶液的恙体积，单位是mLF 样品洛琅的稀释倍数d 比色llJL的先程，单位是cm6 NADPH的消光系数t在340nm =二6.3Lmmo-Icm寸L1A 吸先度值差赏?爵栓测时的股控试验甘油展控溶?费3运个甘油对熊溶液质控的班吊9.2.1 潘加殷陇海荒野皮班体系中9.2.2重新开始进行定量反应0.4g/L之间。样品榕接反应结束，A2值已知，力I0.050mL的员控液加到拉黯提合液中，反应结束后C10m剖，根据上嚣的等式(A3wA2)计算、浓度盏，应该考虑改变后体积。i卖吸光皮值A20可以观察到吸先度程增加。9.2.3 内标质按可以作为自标，对正确的实翰过程进行监割，决定样品潜液中是否有杂展干扰e9.2.4 摆摆试验程序克表2)表2质控试辑程序110 加入比色杯中的榕液自样品标准样品+标准辅蘸混和物1. OOOmL 1. OOOmL 1. OOOmL 1. OOOmL 样品踏液O. 100mL 0.050mL 11 Jj去控潜滚在100mL0.050mL 2支蒸7.l.1. 900mL 1. 800mL 1. 900法L2.000mL 丙黯酸激酶、L-乳酸茹挠O.OlOmL O.010mL 0.020mL 氢酶悬洋物工作壤0.010mL 梅和，歪歪前反应完全反应起，约57min，卖瑕吸光皮直(Al)，按照7.3检测押和u表l桂嚣IJ程序继续操作。标准的阴收率可通过下列公式进行计算2X LlA样品/iiI，股LlA制阴收率=LlA /iil1fl xl00%.，. 5 DB611T 4122007 酣亵A资料性附录注意事项1、缓冲液中含有喜爱酸锅，应避免接触皮肤和呼吸器官，其他用于甘浩检蜒的试剂不具有企险性，但是必续道德慕本的实验室主主掌制度。L试剂应存于2-8CQ建议对黯荆最好现用理军制。3、冷藏的援冲被理ffl前回温E1轰灌茄再使用。4、如果棋盘查Ij吸光度债差销小(如0.100口，则样品济液般意新处理，即在7.3.2测定中可加大样品的体积，减少重蒸7.1.体积，使样品和空白溶液的最重苦体积相同。6 5、可通过回收率检嚣制试过和中的可能损失。6、黯试也可使用德国等生产的商品试剂盒，但操作前绩仔摇摆i卖有关说明书。7、各对照组成立曲情况下方可知定结果。