动物细胞工程Ch1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞工程,云南大学生命科学学院,林洁 主讲,linjie,第一章,绪论,第一节 生物技术与细胞工程,第二节 细胞工程的研究概况,第三节 细胞工程的研究内容,第四节 细胞工程的重要应用,第五节 课程的教学安排,第六节 教材和参考书目,第一节,生物技术,与,细胞工程,美,国国会,科技,评议处,在,1995,年,将,生物技術,(biotechnology),定义为,利用,生物体,或,来自生物体,的,物质,去,制造,或,修饰,某,个产品,，改良,动,、植物或,开发,微生物以做,为,特定之用途。,Bios=,life,；,Teuchos,=,tool,；,Logos,=study of or essence of,.,Biotechnology=,the study of tools from living things,.,一、,生物技术,的,定义,生物技术（,biotechnology,）,就是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计,改造生物体,或,加工生物原料,，为人类,生产出所需要的产品,或,达到某种目的,技术原理与过程。有时也称为,生物工程（,bioengineering,）,。,改造生物体,是指获得优良品质的动物、植物和微生物品系。,加工的生物原料,是指生物的某一部分或生长过程中产生的能利用的物质，如淀粉、多糖、纤维素等有机物。,生产出所需要的产品,包括：粮食、医药、食品、化工原料、能源等。,达到某种目的则包括,：,疾病的预防、诊断与治疗,和,食品的检测,以及,环境污染的检测和治理,等。,生物技术的不自觉应用,第一代生物技术,近代生物技术,现代生物技术,二、,生物技术,的,发展历程,生物技术,的不自觉应用,4000,多年前我国人民就会利用谷物酿酒，这是最早的发酵技术。,公元前,221,年，周朝后期，就能制作豆腐、酱和醋，并一直沿用至今。,當生,面团制,作完成,后，,未,马,上烘焙，便,会进行自发性,的,发酵过,程，,经过,烘烤,后,形成了,质地较轻,、,较蓬松,且美味的,面包,。,在西方，红,酒的起源地,据,信是底格里斯河流域，在某次葡萄果汁受到酵母菌與其他微生物,污染后,自然,发酵,而產生。,第一代,生物技术,1680,年，,Leeuwen Hoek,制成了显微镜后，人们,知道有微生物的存在,。,1857,年，,Pasteur,证实酒精发酵是由活酵母引起的，才逐渐了解到其他,不同的发酵产物也是由不同微生物的作用而形成,，并建立了微生物纯种培养技术。为发酵技术的发展提供了理论基础。,19,世纪末到,20,世纪,30,年代这段时间不少,工业发酵过程陆续出现,，如：乳酸、酒精、面包酵母、丙酮、柠檬酸、淀粉酶等的生产：至此，以,工业微生物过程生产发酵产品,为代表的真正意义上的,生物工程,才,正式诞生,了,“,在含有不同糖成分（包括蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖）的水溶液中，一种从啤酒酵母制备的无细胞榨出汁能导致二氧化碳和乙醇的形成。发酵过程的启动并不需要以活细胞为代表的那样复杂的,“,装置,”,，酵母榨出汁中导致发酵作用发生的只涉及一种溶解了的物质，它无疑是一种蛋白质。我们用,“,酿酶,”,这个名词来标示这种蛋白。,”,爱德华,毕希纳,近代,生物技术,1928,年英国人,弗莱明,复发现了青霉素。,1941,年美国和英国开始合作对青霉素的大规模生产技术进行研究和开发，终于在,1943,年开发出一条青霉素沉浸培养工艺，采用带有,机械搅拌,和,通气,的,密闭式,发酵罐对青霉菌进行培养并用离心萃取和冷冻干燥把青霉素从发酵液中提取出来并进行精制，从而使青霉素的产量和质量大幅度提高。推动了抗生素产业的兴起和发展。,抗生素生产的经验很快地促进了其他发酵产品的发展，最突出的是,20,世纪,50,年代,氨基酸,发酵工业,及,60,年代出现的,酶制剂,工业,。,发酵相关知识积累,至某,个水准后,，便可,大量以工业发酵过程制造,重要,工业,化合物。如,今，,商用,酶制剂,、,氨基酸,、,抗生素,和,维生素,等,工业原料和医药制品，均大量以工业发酵生产,。,现代,生物技术,1972,年，,Berg,首先实现了,DNA,体外重组技术，,DNA,重组技术的建立是现代生物技术的标志,。,1944,年,Avery,利用实验证明了,DNA,是遗传信息的携带者；,1953,年美国的,沃森和克里克,发现了,DNA,的双螺旋结构；,1961,年,Khorana,和,Nirenberg,破译了遗传密码，揭示了,DNA,编码的遗传信息是如何传递给蛋白质这一秘密；,限制性内切酶的发现。,DNA,重组技术使人们可以按照意愿在试管内切割,DNA,，分离基因并经重组后导入其他微生物或细胞，藉以改造生物体，生产新产品,。从而带动了传统生物技术的发展，形成了具有划时代意义和战略价值的现代生物技术。,生物学,化学工程,工程学,化学,生物工程,生物化学,生物技术,现代,生物技术,新兴、前沿学科往往在学科交叉中产生,三、,生物技术,的,四大支柱,生物技术,（生物工程）,基因工程,细胞工程,酶工程,发酵工程,蛋白质工程,细胞工程,与,各生物技术,细胞工程,基因工程,蛋白质工程,产品,酶工程,生化工程,发酵工程,转基因,生物反应器,及分离工程,动植物,细胞培养,酶制剂,应用或生产,细胞工程,(,cell engineering,),细胞工程,主要是以细胞为基本单位，在,体外条件下进行培养和繁殖,；或是应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，,在细胞整体水平或细胞器水平上人为地使细胞的某些生物学特性按照人们的意愿发生改变,，从而获得,新型生物品种,或,细胞产品,的技术过程。,抗,虫,基因,转殖,细胞重组技术与无性繁殖,第二节,细胞工程,与,研究概况,19,世纪,30,年代,施旺,和,施莱登,创立了,细胞学说。,1902,年德国植物学家,哈伯兰德,预言了植物细胞的全能性,，被誉为“植物组织培养之父”。,1907,年美国生物学家,哈里森,采用盖玻片,悬滴培养蛙胚神经组织,获得成功，,开创了动物细胞培养的先河,。,1923,年法国学者,卡勒尔,设计了,卡氏瓶,，并用于多种动物组织培养获得成功。,1934,年荷兰植物学家,温特,发现生长素,，并,证实对植物细胞培养的作用,。,1937,年法国科学家,特里特,和,诺比考特,几乎同时,离体培养了胡萝卜组织,，并使细胞增殖。,1951,年,厄尔利,等人开发了供,动物细胞体外培养的培养基,。,1960,年英国,科金教授,应用酶解得方法，首次成功,从番茄幼苗的根部制备到大量的原生质体,。,第二节,细胞工程,与,研究概况,1972,年美国的,卡尔森等人,人工诱导，将来自不同两种烟草的原生质体进行融合，,获得了第一个体细胞杂种植株,。,1975,年,Milstein,和,konler,将小鼠骨髓瘤细胞与羊红血球免疫过的小鼠,淋巴细胞融合,形成杂种细胞能分泌抗羊红血球抗体，,用于制备单克隆抗体,。,1977,年英国,剑桥大学生物学家爱德华兹,采用胚胎工程技术成功培育出世界首例试管婴儿,。,1981,年,埃文斯,等分别,从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立了胚胎干细胞系,，为胚胎发育及胚胎工程等方面的研究奠定了基础。,20,世纪,80,年代以后随着重组,DNA,技术和细胞融合技术的迅速发展，,动物培养技术被广泛用于生产各种特殊的生物制品,。,1997,年英国,利用成年动物体细胞首次克隆出绵羊“多利”,。,2001,年英国又宣布,成功培育出世界首批转基因克隆猪,。,2007,年山中伸弥等成功把人类皮肤细胞转化成人工万能干细胞，并成功使这些干细胞转化成为身体器官的一部份。,第三节,细胞工程,的,研究内容,根据研究对象的不同：,微生物细胞工程,植物细胞工程,动物细胞工程,根据研究水平来划分：,组织水平,细胞水平,细胞器水平,基因水平,根据,技术范围,细胞与组织的培养技术,细胞融合技术,胚胎工程,细胞重组与克隆技术,转基因技术,染色体工程,细胞,与,组织培养技术,细胞与组织培养技术,就是从动物或植物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内的生理环境，在,无菌,、,适温,和,丰富的营养条件,下，使离体细胞或组织,生存,、,生长,并,维持结构,和,功能,的一门技术,动物细胞与组织培养技术是动物细胞工程中最重要的组成部分，该技术是动物细胞工程的基础。同时，动物细胞体外培养，不受气候、季节等因素的限制，可用于制取许多有应用价值的细胞产品（单抗、细胞因子、疫苗、酶制剂等等）；此外胚胎干细胞的培养和人工诱导分化具有显著的潜在价值。,细胞融合,技术,细胞融合（,cell fusion,）,又称细胞杂交（,cell hybridization,）。它是指用人工的方法使两种或几种以上的,体细胞,合并形成一个细胞，,不经过有性生殖过程,而得到杂种细胞的方法，在自然情况下，体内或体外培养细胞间所发生的融合，称为自然融合。而在体外用人工方法（使用融合诱导因子）促使相同或不同的细胞间发生融合，称为人工诱导融合。,1975,年,Milstein,和,konler,将小鼠骨髓瘤细胞与羊红血球免疫过的小鼠淋巴细胞融合形成杂种细胞能分泌抗羊红血球抗体，用于制备单克隆抗体。,胚胎,工程,胚胎工程主要是对哺乳动物的胚胎进行某些人为的工程技术操作获得人们所需要的成体动物。胚胎工程采用的新技术包括：,胚胎分割技术,、,胚胎融合技术,、,卵核移植技术,、,体外受精技术,、,胚胎培养,、,胚胎移植,以及,性别鉴定技术,、,胚胎冷冻技术,等。,优良品种的快速繁殖与胚胎保存。,试管婴儿培育技术。,细胞重组,与,克隆技术,细胞重组技术,就是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种实验技术。,细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一个活体的自我装配，而细胞重组则是,离体的装配过程,。利用该技术人们可以人为地使细胞表达新的性状和产生新的产品。,克隆动物的产生是细胞重组技术最令人瞩目的应用。,转基因,技术,转基因技术,就是指将外源基因整合到生物体内，得到稳定表达，并使该基因能稳定地遗传给后代的试验技术。是改变物种遗传性状、获得新生物品种和生产新型生物制品的最有效途径。已在微生物、动植物领域得到迅速发展。,目前，转基因动物及转基因生物反应器已经在生物医药、异种器官移植和畜牧业等领域显示了广阔的应用前景。,转基因技术和细胞重组技术共同组成了细胞遗传工程。它们代表了现代细胞工程，甚至是整个生物技术的前沿领域。,染色体,工程,染色体工程,是按照预先的设计，添加、消除或替代同种或异种染色体的全部或一部分，从而达到定向改变生物遗传性状或选育新品种的目的。他是从染色体水平改变细胞遗传组成的细胞工程技术。目前主要应用于植物遗传育种领域。,动物染色体工程主要采用对细胞进行微操作的方法（如微细胞转移方法等）来达到转基因的目的,。,第四节,细胞工程,的重要,应用,目前，细胞工程已经渗透到人类生活的许多领域，取得了许多具有开创性的研究成果，有的已经在生产中推广，收到了明显的经济和社会效益。随着细胞工程技术研究的不断深入，它的前景和产生的影响将会日益地显示出来。,稀有动植物资源的保存和保护,提高农作物品质,新型动植物品种的培育,生产生物活性产物、药品等,建立疾病的新型治疗方法,供医学器官修复或移植的组织工程,转基因动植物的生物反应器,在能源、环境保护等领域的应用,在生命科学研究各领域中的应用,稀有动植物资源的保存和保护,细胞工程,与,农业,每一植物細胞都有,极,強的再生能力,再生植株,紫杉醇,Nature Biotechnology,溶解細胞壁,原生,质体,愈伤组织,Scientific American,Life Processes of Plants,植物細胞再生,多,莉,母亲,的,乳腺細胞核,代理孕母的,无,核卵母細胞,单性生殖：,胚胎的,遗传,信息,仅,來自,单,一細胞,沒有,经过受精过程,复制,生物,代 母,由化石所得,DNA,來,复制,生物,还,只是科幻,电影,牛頓,株罗纪公园,提高农作物品质，发展畜牧业生产,抗,虫,基因,转殖,植物,基因,转殖,番茄殖入反,义,基因,可防止,软,化,抑制果肉,软,化的,酶,(,果,胶酶,pectinase),Nature Biotechnology,反,义,基因,新型动植物品种的培育,原生,质,体細胞融合,J.F.Shepard(1983),Science,219,:683-688,Potato,Tomato,+,Pomato,利用细胞工程技术生产生物活性产物、药品等,细胞工程,与,医药健康,牛頓,(1985)no.23 p.100,National Geographic,細胞融合,融合瘤,单克隆抗体,的高度,专,一性有很多用途,单克隆抗体,是,对,其抗原有,极强专一性,的,魔弹,(magic bullet),或,巡,航飞弹,研 究,以免疫,转,印法,侦测,特定抗原,医 疗,以毒素,连接,抗体,攻击,病变,細胞,检 验,以,ELISA,侦测,特定,病原体,以,单,克,隆,抗,体,來,清,除,体,內,癌,細,胞,National Geographic,利用生物反应器大规模培养动物细胞生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等已成为生物医药高技术产业的重要部分：,目前动物细胞生物反应器培养生产的生物制品主要有以下几类：,病毒疫苗（乙肝疫苗、脊髓灰质炎疫苗、狂犬疫苗）,非抗体免疫调节剂（干扰素、白细胞介素、,B,细胞生长因子、巨噬细胞激活因子等）,多肽生长因子（神经生长因子、成纤维生长因子、表皮生长因子、血清生长因子等）,酶类（组织纤溶酶原激活剂等）,激素（红细胞生成素、促黄体生成素、促滤胞素等）,肿瘤特异性抗原（癌胚抗原、甲胎抗原等）,单克隆抗体,病毒杀虫剂（杆状病毒等）,1996,年至,1997,年使用哺乳动物细胞系生产的获得许可的诊断用重组生物制品（,BLA,）产品,BLA,名称,生产商,批准日期,产品类型,细胞系,方法,培养基,人,I,，,II,型,T,淋巴病毒,Abbott HTLV-1/HTLV-2 EIA,TM,（用于酶免疫分析）,Abbott Laboratories,8/15/1997,鼠单克隆抗体，鼠人,IgG1,慢性感染的人,T,和,B,淋巴细胞,未公开,未公开,Capromab pendtide/ProstaScint,TM,（癌症造影剂）,Cytogen,10/28/1996,单克隆抗体（,mAb,）,鼠杂交细胞系,中空纤维,无血清，含牛血清白蛋白和转铁蛋白,Nofetumomab/Verluma,TM,（癌症造影剂）,Dr Karl Thomae,8/20/1996,单克隆抗体（,mAb,），鼠抗,IgG1,哺乳动物细胞,未公开,无血清,Imciromab pentetate/Myoscint,TM,（心脏造影剂）,Centocor,7/3/1996,单克隆抗体（,mAb,），鼠抗,IgG2b Fab,片段,鼠杂交瘤细胞系,未公开,含血清，含庆大霉素,1997,年至,1998,年使用哺乳动物细胞系生产的获得许可的疫苗及细胞用重组生物制品（,BLA,）产品,BLA,名称,生产商,批准日期,产品类型,细胞系,方法,培养基,Rotavirus,疫苗（狂犬病疫苗）,Wyeth Laboratories,8/31/1998,活病毒疫苗,FRh1-2,未公开,培养基中含胎牛血清，新霉素硫酸盐和两性霉素,Rabavert,用于狂犬病的免疫,Chiron Behring,10/20/1997,疫苗,未公开,未公开,未公开,甲肝疫苗灭活,VaQTATM,（用于预防甲型肝炎）,Merck&Co,3/29/1996,灭活病毒,人,MRC,5,二倍体细胞,贴壁，,NCF,到,Costar,培养管，连续补料培养,含血清,自体培养软骨细胞,Carticel SM ServicesTM,（修复软骨性缺陷）,Genzyme tissue,8/22/1997,自体同源细胞,软骨细胞,组织培养瓶,含血清,1998,年至,1999,年使用哺乳动物细胞系生产的获得许可的治疗用重组生物制品（,BLA,）产品,BLA,名称,生产商,批准日期,产品类型,细胞系,方法,培养基,n1,干扰素,lymphoblastoid/Wellferon,TM,（治疗慢性丙型肝炎）,Wellcome Foundation Liminted,3/25/1999,内源糖蛋白,人淋巴细胞,未公开,未公开,血凝因子,VIIa,（重组）,NovoSeven,TM,（用于治疗,A,型和,B,型血友病）,Novo Nordisk A/S,3/25/1999,重组糖蛋白,BHK,未公开,含新生牛血清,Etanercept/Enbrel,TM,（治疗风湿性关节炎）,Immunex,11,2,1998,IgG1,与,TNF,受体融合,CHO,搅拌釜式反应器，悬浮,未公开,Trastuzmmab/Herceptin,TM,（治疗转移性乳腺癌）,Genentech,9/25/1998,单克隆抗体（,mAb),带有鼠,CDRs,的人源化,IgG1,CHO,搅拌釜式反应器，悬浮,无血清，含庆大霉素,Infliximab/Remicade,TM,（治疗局部性回肠炎）,Centocor,8/24/1998,单克隆抗体（,mAb),鼠人嵌合抗体,IgG1,鼠杂交瘤细胞系重组,NSO,搅拌釜反应器，悬浮，灌流培养（旋转过滤器）,无血清，含蛋白水解物，牛转铁蛋白，胰岛素，血清白蛋白和,Excyte,TM,1996,年至,1998,年使用哺乳动物细胞系生产的获得许可的治疗用重组生物制品（,BLA,）产品,BLA,名称,生产商,批准日期,产品类型,细胞系,方法,培养基,Palivizumab/Synagis,TM,（预防呼吸性融合细胞病毒）,Medimmune,6/19/1998,单克隆抗体（,mAb,）,鼠杂交瘤细胞系重组,NSO,搅拌釜反应器，悬浮，补料培养,无血清,Basiliximab,Simulec,TM,（预防急性器官排斥反应）,Novartis Pharmacerticals,5/12/1998,单克隆抗体（,mAb),鼠人,IgG1,鼠杂交瘤细胞系重组,NSO,搅拌反应器，悬浮，灌流培养,无血清,Daclizumab/Zenapax,TM,（预防急性器官排斥反应）,Hoffman-La-Roche,12/10/1997,单克隆抗体（,mAb),鼠人,IgG1,SP2/0,未公开,未公开,Rituximab/Rituxan,TM,（治疗,B,细胞非,Hodgkin,淋巴瘤病）,IDEC-Pharmacertical/Genentech,11/26/1997,单克隆抗体（,mAb),鼠人,IgG1,CHO,搅拌釜反应器，悬浮,含庆大霉素,血凝因子,IX,（重组）,Benefix,TM,（控制,B,型血友病人的出血发生率）,Genetics Institute,2/11/1997,重组糖蛋白,CHO,搅拌釜反应器，悬浮，批式补料培养,无血清，含重组胰岛素,干扰素,1a,Avonex,TM,（用于多发性硬化的治疗）,Biogen,5/17/1996,重组糖蛋白,CHO,搅拌反应器，悬浮,未公开,2000,年使用哺乳动物细胞系生产的获得许可的诊断用重组生物制品（,BLA,）产品,BLA,名称,生产商,批准日期,产品类型,细胞系,方法,培养基,ID Micro Typing System,（,Anti-A,）,Micro Typing System,，,Inc,09/21/2000,鼠单克隆抗体,BIRMA-1,细胞系,未公开,未公开,ID Micro Typing System,（,Anti-B,）,Micro Typing System,，,Inc,09/21/2000,鼠单克隆抗体,LB-2,细胞系,未公开,未公开,ID Micro Typing System,（,Anti-A and Anti-B,）,Micro Typing System,，,Inc,09/21/2000,鼠单克隆抗体,ES,15,细胞系,未公开,未公开,ID Micro Typing System,（,Anti-D,）,Micro Typing System,，,Inc,09/21/2000,人单克隆抗体,MS201,细胞系,未公开,未公开,2000,年至,2002,年使用哺乳动物细胞系生产的获得许可的生物制品（,BLA,）产品,BLA,名称,生产商,批准日期,产品类型,细胞系,方法,培养基,Rebif,（降低回归热性硬结病人临床病情恶化）,Serono,3/7/2002,干扰素,1a,CHO,Aranesp,（治疗慢性肾衰相关的贫血）,Amege,9/17/2001,TWINRIX,（甲肝灭活和重组乙肝疫苗）,SMITHKLINE,Beecham Biologicals,5/11/2001,MRC-5,生产甲肝疫苗，酵母生产乙肝疫苗,Campath,（治疗,B,细胞慢性淋巴细胞白血病）,Millennium and ILEX Partners LP,5/7/2001,CHO,悬浮培养,含,neomycin,Tenecteplase/TNKase,TM,（降低急性心肌梗塞死亡率）,Genentech,6/2/2000,重组糖蛋白,CHO,未公开,未公开,抗血友病因子（重组）,ReFacto,TM,（控制血友病发生率）,Genetics Institute,3/6/2000,重组糖蛋白,CHO,连续灌流,无血清，含有人血清白蛋白和重组胰岛素,新型治疗方法的建立,Campbell (1990),Biology,p.351,遗传,缺陷,取出病人細胞,腺病毒,adenovirus,插入修正基因,感染病人細胞,注射修正細胞,修正基因,修正基因,转,入病人,细,胞中,基因治,疗,TIL,细胞（肿瘤浸润淋巴细胞）与癌症等生物治疗,TIL,细胞的发现与概念,TIL,细胞具有比,LAK,细胞更强的杀伤肿瘤作用；,TIL,细胞同样并非是一个独立的淋巴群或亚群；而是应用,动物肿瘤组织中分离出的淋巴细胞,，,加入,IL-2,在进行,体外共培养,，而获得的培养细胞；,LAK,细胞具有广谱杀瘤作用，而,TIL,细胞有特异杀瘤作用。,TIL,前体细胞为,Lyt-2+,（,CD8,+,），与杀伤,T,细胞的表面标记相同；,TIL,细胞对肿瘤的过继免疫治疗更具有应用前景。,生物,治,疗,供医学器官修复或移植的组织工程,基因改造方法可去除,猪,細胞上引起,人,体,排斥,的,标志,异种,器官移,植,猪,細胞,表面抗原,人类抗体,猪,細胞,X,体,細胞只有,少数能够进行,分化,干细胞,脐,帶血,IPS,转基因动物模型,动物生物反应器与,动物药厂,在生命科学研究各领域中的应用,细胞工程,与,生命科学研究,第六节,课程,的,教学安排,第一章 绪论,第二章 动物细胞培养的基本常识,第三章 动物细胞培养的生物学,第四章 动物细胞（组织）培养的基本技术,第五章 干细胞培养技术（自学）,第六章 动物细胞融合技术与单克隆抗体,第七章 动物细胞重组技术与动物克隆,第八章 转基因动物与转基因动物生物反应器,动物细胞与组织培养技术,*,教材,与,参考书目,参考教材,细胞工程,李志勇编著 科学出版社,21,世纪高等院校教材,参考书,动物细胞工程与实践,李青旺主编 化学工业出版社,生物技术概论,宋思扬等主编 科学出版社,21,世纪高等院校教材,现代生物技术,瞿礼嘉 陈章良等 高等教育出版社,