PCR操作规范.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,临床基因扩增检验操作规范,浙 江 省 基 因 诊 断 中 心,浙江大学医学院附属儿童医院,尚世强,一、临床基因扩增检验实验室的,规范化设置及其各室的功能,二、各阶段操作要求,三、,PCR,污染与对策,四、因操作欠规范导致的问题分析,一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能,规范化设置：,要求参照,临床基因扩增检验实验室管理暂行办法,（卫医发2002 10号文）附件,临床基因扩增检验实验室基本设置标准,。,1,.,四个隔开的工作区域中每一区域都须有,专用,的仪器设备。,2.明确的,标记,，如加样器或试剂等。,3.,单一方向,顺序，从试剂贮存和准备区、标本,制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简,称扩增区）至产物分析区。,4.使用,不同颜色,或有明显区别标志的工作服。,5.实验室的,清洁,应按试剂贮存和准备区至扩增,产物分析区的方向进行。,6.,各自,的清洁用具。,各室功能：,（一）试剂贮存和准备区,功能：,贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备,。,要,正确,使用加样器。,正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。,为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须,盖好,含反应混合液的反应管。,对具有潜在传染危险性的材料，必须有,明确,的样本处理和灭活程序。,用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。,用于,RNA,扩增检测的样本制备好以后，应,立即,进行,cDNA,合成。,（三）扩增区,功能：,DNA,或,cDNA,扩增,。,已制备的,DNA,模板和合成的,cDNA,的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。,在巢式,PCR,测定中，第二次加样必须在本区内进行。,可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。,如有加样则应在超净台内进行。,打开反应管前快速离心数秒。,（四）扩增产物分析区,功能：,扩增片段的测定。,膜上微孔板上探针杂交方法、,Southern,转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。,本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意实验人员的,安全防护,。,负压条件。,二、各阶段操作要求,测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。,（一）标本的采集,临床标本包括,EDTA,或,枸橼酸钠,抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。,EDTA,和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因,肝素是,Taq,酶的强抑制剂,。,玻璃器皿在使用前应高压处理，250,烘烤,4小时以上可使,RNA,酶永久性失活。,临床用于,RNA（,如,HCV RNA）,扩增检测的血标本应尽快（,3小时以内,）分离血浆，以避免,RNA,的降解。,（二）标本的稳定化处理,DNA：,不需特殊稳定化处理。,RNA：,异硫氰酸胍盐（,GITC）,可使,DNA,酶和,RNA,酶失活。,（三）标本的运送,可在常温下通过邮寄运送，如用于,DNA,扩增检测的,EDTA,抗凝全血及用于,RNA,扩增检测的,GITC,稳定化处理的标本。,未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。,（四）标本的贮存,1.血清/血浆等-70,2.用于,DNA,测定的已,纯化核酸,样本 4,3.用于,RNA,测定的已纯化核酸样本-80,4.用乙醇沉淀的核酸样本-20,5.GITC,处理的,RNA,标本在室温可保存7天,（五）标本的处理（核酸提取）,抑制物,可能来源于：,标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。,核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等）。,痰须液化处理。,操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）,注意：,离心管不能插得过低，以防进水；,水浴时不能加盖，防管盖爆开；,水浴时间须准确，101,min；,水浴时不能走开；,左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。,（六）靶核酸的逆转录（,RT）,和扩增,有多种因素可引起核酸扩增检测,假阴性,结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、,Taq,酶失活、退火温度不对、,Mg+,浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。,扩增仪孔中热传导的,均一性,极为重要。,RT-PCR,操作注意：,标本必须新鲜；,做,RNA,标本的枪头离心管必须无菌；,冰上操作；,处理完后须立即上机，不能放置；,注意左右手分开。,（七）扩增产物的分析,扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。,实时荧光定量,PCR,在荧光定量,PCR,基础上实时监测,PCR,全过程，最后通过曲线进行定量分析。,与一般荧光定量,PCR,使用荧光强度定量不同，实时荧光,PCR,一般使用,Ct,（每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数）定量，,Ct,与模板初始拷贝数的对数成线性关系。,实时荧光,PCR,的优点：,精密度高，重复性能好。,TaqMan,荧光定量,PCR,原理,探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；,探针与模板杂交在引物区间内，当扩增进行时，,Taq DNA,聚合酶的,5-3,外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产生荧光信号；,荧光信号强度与扩增产物量成正比；,三、,PCR,污染与对策,PCR,污染分环境污染与反应液污染二种。常见,PCR,污染源有三个：,第一、标本间的交叉污染；,第二、实验室中克隆质粒的污染；,第三、,PCR,产物,的污染（,Carryover,）。,要防止,PCR,污染，必须做好以下3个环节的工作：,（一）污染的预防,（二）污染源的追踪,（三）污染源的处理,（一）污染的预防,操作,PCR,时，按照下述规则可有效地预防,PCR,的污染。,1、,PCR,的前处理及后处理要在不同的隔,离工作台上或房间内进行。,2、分装试剂，标记批号,3、改进实验操作：,(1)带一次性手套；,(2)避免反应液的飞溅；,(3)用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于,空气，以免产物气溶胶污染；,(4)操作多份样品时，要先将可混匀的成分,(,dNTPs，,缓冲液，引物等)一起制备标准,混合液(,Master mix)；,(5),制备反应混合液时，最后加入样品,DNA，,加入,DNA,后，在进行下一步操作前要盖紧,反应管。,4、检查结果的可重复性。,（二）污染源的追踪,1、阳、阴性对照,选择阳性对照时，应选择扩增,弱,，,且,重复性好,的样品。,阴性对照的选择一定要小心。,不含模板,DNA,的,PCR,试剂对照。,2、常见的环境污染源有,(1)点杂交的点样器；,(2)切片机；,(3)离心机；,(4)切胶用刀或微解剖刀；,(5)浓缩用具，真空瓶；,(6)电泳装置和紫外灯箱；,(7)干冰/乙醇或水溶锅；,(8)冰箱门把手、冷冻架和门把手。,追踪可疑的环境污染源,用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分,在,0.1,ml,去离子水中浸泡；,取,5,l,作,PCR,反应；,电泳检查结果。,（三）污染源的处理,1.环境污染处理法,（1）,稀酸处理法,。,对擦试实验阳性部位或器件可用1,mol/LHCl,擦洗或浸泡残留,DNA。,（2）,紫外法,：,UV,照射波长一般选择254/300,nm，,需考虑,PCR,产物的长度与产物序列中碱基的分布。,UV,对长片段（,500,bp,以上）有效，而对短片段效果不大。,2.反应液的污染处理法,(1),DNaseI,法,：,PCR,混合液（不加模板和,Taq,酶）中加入0.5,U DNaseI，,室温下作用30,min,后，加热灭活，加入模板和,Taq,酶后即可进行正常,PCR。,优点：便宜，不需知道扩增,DNA,序列。,(2),内切酶法,：,选择识别四个碱基的内切酶（如,MspI,等），最好几种合用，可克服其识别序列特异的缺陷。方法同上，只是,DnaseI,由内切酶（,MspI10U）,代替，作用时间延长到1.01.5,h。,(3),紫外照射法,：,反应中不加模板与,Taq,酶。,(4),尿嘧啶,DNA,糖基化酶（,UNG）,法,：,dUTP,代替反应中的,dTTP，,使产物中含大量,dU，UNG,可去除,dU，,使失去,dU,的位置，阻止,Taq,酶的延伸。,PCR,正常循环前，用,UNG,处理,PCR,反应混合液可消除,PCR,产物的污染，而,UNG,在正常,PCR,循环变性一步就会失活，所以，对含,dU,的新合成,PCR,产物没有影响。,T A T A T,A T A T A,PCR,A U A,U A U,UNG,A A,A,加热,A A,A,PCR,该法,优点,：,去除任河来源（包括引物在内）的,污染；,由于污染的产物有大量,dU,存在，,因此，,UNG,处理会彻底消除污染。,UNG,处理与,PCR,扩增可在同一试管,内进行。,四、因操作欠规范导致的问题分析,（一）实验室仪器设备,1、设备不齐全、不配套，使得实验结果不稳定，引起假性结果。,旋涡混合器,，微量加样器，正规的紫外透射仪。,RNA PCR,样品处理时，血清（或血浆）中加入强,烈变性剂后，血样中的蛋白变性、结块。,吸头与微量加样器不配套。,2、,PCR,热循环仪的差异或质量问题。,移液器：,严禁大力来回拧动；,严禁调至容量之外使用；,第二档为排空档，不得作吸取之用；,吸头应浸入液面23,mm,处吸取；,严禁将有液体的移液器平放或倒置；,混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解；,每周用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。,离心机：,离心前，离心管须配平；,将调速档打至0档位，才能打开电源开关，逐渐升高转速，直至即定转速；,定时旋钮不能强行归零；,转头未停止时，严禁打开盖板。,（二）实验室布局不合理引起的污染问题,1、样品处理不进行隔离，,样品中各种核酸片,段均会通过空气进行传播,。,2、,PCR,结果检测实验室和其它实验室在一,起，,会出现严重的扩增子污染,。,3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公,用，,也会造成严重污染。,4、实验室操作垃圾（,吸头、离心管、样品杯 等,）乱,放，,飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室,污染。,（三）,PCR,操作中存在问题分析,1.,阳性变阴性,2.,阴性变阳性,3.PCR,结果不稳定,1.,阳性变阴性,(,1),有些阳性病人，经过,PCR,检测后为阴性，可能有两种情况：,一是采集标本方法或部位不正确，,二是如果病人取样部位病原体消失，需根据病人的病理情况采样。,(2),标本保存不当，可引起,PCR,失败。,收集的标本乱放（未放冰箱），病原体的破裂，检测的核酸降解，失去了,PCR,检测的模板或造成标本污染。,2.,阴性变阳性,常见的原 因有以下6点：,加入试剂或样品时引起的交叉污染,（最好在加完所有其他反应成分，包括防止蒸发用的矿物油后才吸加,模板,DNA,，,将模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻单击管侧壁，以摇匀液体，再作瞬时离心10秒，使水相和有机相分开）。,加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染,（将模板,DNA,加入,PCR,系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。,打开标本管盖引起样品飞溅,（打开前须瞬间离心）,操作时手套引起的交叉污染,（拿过模板,DNA,管后应更换手套）,不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染,（必须设置一个不含模板,DNA,但含,PCR,系统中所有其他成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他,PCR,以后才进行吸加）。,实验室污染,3.,PCR,检测结果不稳定,（1）样品处理方法不当，标本中杂质很多，,血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。,蛋白质,DNA,电泳带拖尾,血红素中的卟啉化合物抑制,Taq,酶活性,代谢产物干扰引物配对,（2）操作不当带来的后果,主要指不能严格按照说明进行操作造成,PCR,检测失败。,如,HCV RNA PCR,样品处理试剂,A、B、C,和75%乙醇的操作过程。,50,l,血清标本,(标本可用血清或血浆，尽量避免使用肝素做抗凝剂，,避免反复冻融),加200,l,试剂,A,后立即混匀,(试剂,A,是强烈的,变性剂,，不仅要将病毒外壳变性裂解，释放,核酸，而且要将样品中包含的其它蛋白（包括,RNase）,变性，,以避免蛋白进入,PCR,反应体系（,RNase,降解,RNA,模板），干,扰,PCR,扩增；,混匀,这一步至关重要，一定要振荡混合均匀才,能达到充分变性的结果。),加入试剂,B（,氯仿、异戊醇）50,l,混匀,（抽取变性剂及变性的蛋白，分离出核酸，同样必须充分,混匀,，否则也会引起,PCR,检测失败),14 000,r/min,离心5,min,取上清80100,l,(,取上清一定要,小心,，不能抽取中间蛋白沉淀层，否则,因核酸沉淀中含有变性蛋白，引起,PCR,检测失败),加等体积试剂,C14 000r/min,离心10,min，,弃上清,(将核酸从水溶液中沉淀浓缩),用75%乙醇洗一次,(除去与核酸共沉淀的盐及杂质),干燥备用,(干燥后，切勿将管子,倒置,或掉落，防止沉淀飞出管底),在痰标本处理时液化是十分重要的，痰没有彻底液化，病原体不能完全释放出来；反之液化过度会使病原体裂解，导致,PCR,检测失败。,总之，,样品处理,对,PCR,检测是至关重要的，是导致,PCR,检测失败的最常见原因之一。,谢谢,