病毒学检验-第二章-鸡胚和动物接种技术-2015.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,病毒学检验,病毒学检验,病毒学检验,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,病毒学检验,病毒学检验,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,病毒学检验,病毒学检验,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,病毒学检验,病毒学检验,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,*,病毒学检验,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,第二章 鸡胚和动物接种技术,Chapter2 Inoculation,technology of,embryo and animal,医学检验教研室,李文娟,2,本章内容,第一节 鸡胚接种技术,第二节 动物接种技术,第三节,鸡,胚和动物接种技术,在,病毒,检验中的应用,掌握,鸡胚接种途径及方法、病毒的检测,实验动物的种类、实验动物接种途径和接种方法,熟悉,鸡胚孵育与检查、鸡胚接种所需实验材料与器械,实验动物编号和分组、接种后的观察等,问题,了解,鸡胚的解剖与生理；,鸡胚和实验动物接种技术在病毒检验中的应用,教学要求,3,4,方法,应 用 价 值,存 在 问 题,动物接种,应用最早；,方法简便；,结果易于观察,自身带病毒；,有的接种后不敏感；,动物饲养问题,鸡胚培养,来源客观，易于管理，带病毒机会少；多途径接种,敏感病毒谱窄,细胞培养,应用广泛，敏感病毒谱广,设备技术要求条件高,病毒分离培养常用方法,第一节 鸡胚接种技术,6,概况,1911,年,Rous,和,Murphy,首先应用鸡胚培养研究肉瘤病毒(,Rous,肉瘤)的繁殖。,1938,年,Goodpasture,和,Burnet,等应用鸡胚繁殖病毒、,Cox,应用卵黄囊培养立克次氏体。,9,一、鸡胚的结构与生理,鸡胚是由,外胚层、中胚层和内胚层,三个胚层发育起来的，它们共同构成了胚胎的组织与器官。,卵白,尿囊腔,卵黄,气室,卵壳,壳膜,绒毛尿囊膜,羊膜,羊膜腔,鸡胚胎,9,11,日龄鸡胚结构,10,11,卵壳与壳膜,卵壳位于最外层的坚硬壳层,壳膜位于卵壳的下层，允许气体和液体分子交换,气室,功能主要是呼吸和调节压力,绒毛尿囊膜,壳膜之下，主要是胚胎的呼吸器官,羊膜,胚胎的最内层包被，含羊水，胚胎在其中。,12,尿囊腔,位于绒毛尿囊腔和羊膜之间，胚胎排泄器官；含,5,20ml,尿囊液，含大量的尿酸盐,卵黄囊,主要营养的储藏场所，为胚胎提供营养,卵白,外于卵的锐端，为胚胎发育晚期提供营养,13,14,二、鸡胚的孵育和检查,一、受精鸡卵的选择,没有受到,病毒和细菌,的污染如新城鸡瘟病毒、布氏杆菌等；,培养立克次体和衣原体，不能来自食用,抗生素,的鸡群。,二、鸡胚的孵育,孵育的温度,38,39,孵育的湿度,40,70,翻卵 每天,180,转动鸡胚,1,2,次,通风 排出,CO,2,，吸入,O,2,鸡卵,发育中的胚胎,发育中的胚胎,破壳而出的小鸡,卵白,卵黄,系带,胚盘,16,17,三、检卵,目的,了解鸡胚的存活情况，标记,气室边界,和,胚胎位置,；,观察接种后,胚胎的状况,观察内容,血管是否明显,有无胎动,绒毛尿囊膜发育之界线,18,19,三、鸡胚的接种途径及方法,一、实验材料与器械,受精鸡卵,孵卵箱,检卵灯、照明灯、卵杯、卵盘、鸡胚开孔器,其它器材,20,二、接种途径与方法,羊膜腔接种：,主要用于临床材料（如患者咽漱液等）分离,流感病毒,。,绒毛尿囊膜接种：,常用于,牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒,的分离；病毒滴定、中和试验。,尿囊腔接种：,广泛应用于,流感病毒、流行性腮腺炎病毒、新城鸡瘟病毒,的适应和传代。,卵黄囊接种：,主要用于虫媒病毒、衣原体、立克次体等分离和繁殖；抗流感病毒药物实验。,21,1,、羊膜腔接种,分离,流感病毒，,收获羊水和尿囊液,。,羊膜腔接种示意图,接种步骤与方法,将,1012,日龄的鸡胚在检卵灯上照视，标记气室及胚胎的位置。,消毒气室部位的蛋壳，在气室顶端钻出一约,10mm6mm,的长方形裂痕，注意勿钻破壳膜。,再次消毒钻孔区后，用灭菌的小镊子除去长方形卵壳和外层壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上，使其透明，以便观察胚胎的位置。,将注射器刺向胚胎的腭下胸前，以针头拨动下颚及腿，当进入羊膜腔内时，可看到鸡胚随针头的拨动而动，此时可注入,O.1,0.2ml,病毒液。,拔出针头，孔区消毒后用沾有碘酒通过火焰的小块胶布将卵壳的窗口封住，于,33,35,孵育,48,72h,，要保持鸡胚钝端朝上。,解剖与收获,收获前鸡胚须置,4,冰箱,6h,或过夜,，但不能放置时间过长,(,过长会引起散黄,),。如急于收获亦可置,-20,冰箱,lh,左右。,预冷的目的是，将,鸡胚冻死，使血液凝固，避免收获时流出红细胞，并同尿囊液的病毒发生凝集，造成病毒滴度下降。,病毒通过胚胎机体后被排泄入尿囊腔，因此当羊水过少时，可用同胚少量尿囊液冲洗羊膜腔并吸取该洗液。,24,2,、绒毛尿囊膜接种,牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹,病毒的分离,，可在膜上可形成,斑点状或痘疱状病灶,。,病毒滴定,，感染性病毒颗粒的数目可以通过产生的斑和痘的数目来计算。,抗体滴定,，即在有抗体存在的情况下，痘疱形成受到抑制。,25,定位,将胎盘部分及自然气室部分用铅笔画出；,在,与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育较好的卵壳上划,一直径约1,cm,的,等边三角形,卵窗,接种步骤与方法,26,绒毛尿囊膜接种示意图,取卵壳；,造人工气室；,接种；,消毒；,培养。,用,2.5,的碘酒和,75,的酒精分别消毒人工气室上的卵壳，去除窗孔上的胶布。,用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下,，放入加有灭菌生理盐水的培养皿内，观察病灶形状或用于传代，或用,50,甘油保存。同时作无菌培养。,27,解剖与收获,28,3.,尿囊腔接种,流感病毒,、,流行性腮腺炎病毒,和,新城疫病毒,的传代。,尿囊腔接种示意图,29,照胚：,取,911,日龄发育良好的鸡胚，观察气室及胚胎位置，标出气室底边，在,无大血管处标出尿囊腔注射部位,。,接种步骤与方法,30,标记气室和胚胎位置,31,消毒,气室向上放置鸡胚于卵架上；,先后用碘酊和酒精棉球消毒蛋壳所标记的位置。,打孔,在所标记注射部位用剪刀尖端打孔；,注意用力要稳，恰好使蛋壳打通而不伤及壳膜。,距气室底边,0.5cm,32,接种部位消毒,33,注入病毒材料,用,1mL,注射器抽取接种物；,针头垂直刺入注射部位,1-1.2cm,即达尿囊腔内；,注入待接种的病毒液：接种量为,0.10.2mL,。,34,封孔,用熔好的石蜡或消毒胶布封闭注射孔。,孵育与观察,气室朝上于,37,温箱中孵育；,以后每天检卵,12,次。,弃去,24h,内的死亡鸡胚：,机械损伤、细菌或霉菌污染等引起。,35,收集,24h,后死亡鸡胚，置,4,冰箱过夜，以免收获时流血,;,取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面；,用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜；,以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取尿囊液,，置无菌容器中保存备用。一般能尿囊液,6-10mL,。,取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。,解剖与收获,36,收获尿囊液,每枚鸡胚收获尿囊液,6,8ml,37,4.,卵黄囊接种,用于,虫媒病毒,、,衣原体,及,立克次体,等的分离和繁殖。,卵黄囊接种示意图,38,四、病毒的检测,（一）无菌试验,目的：证实鸡胚收获物是否受到细菌的污染。,方法：,将鸡胚组织或收获的第一滴液体接种无菌肉汤；,37,培养,36h,。,结果判定,肉汤清亮透明，说明没有污染；,肉汤混浊，或有菌落出现，说明鸡胚被细菌污染。,39,（二）检测方法,直接观察法,绒毛尿囊膜上形成,损害或痘疱,：如痘类病毒和疱疹病毒。,引起,鸡胚死亡,：如新城疫病毒、流行性乙型脑炎病毒。,造成鸡胚特殊损害和胚胎生长迟缓，如马流感病毒。,实验检测法,血凝和血凝抑制试验,：流感病毒,补体结合试验：腮腺炎病毒,其他：,PCR,等,40,第二节 动物接种技术,实验动物（,experimental animals,）,是指经,人工饲养,，,遗传背景明确,、来源清楚，,控制其携带的微生物,，用于科学研究、教学、生产、鉴定以及其它科学实验的所有动物。,42,43,发现,年份,发现人,所用动物,血液循环,1628,哈维,蛙、蛇、鱼、蟹、其他,醚麻醉,1846,玛登,鸟类、其他,细菌与疾病的关系,1878,科赫,牛、羊、其他,细菌致弱用免疫,1880,巴斯德,鸟类,狂犬病免疫,1885,巴斯德,鸟类、家兔,虫媒传播疾病,1898,史密斯等,牛,蚊传播疟疾,1898,罗斯,鸟类,医学科学的重大发现与动物实验的关系,44,发现,年份,发现人,所用动物,肿瘤的病毒病原,1910,洛斯,鸡,胰岛素,1921,班定,狗,休克治疗,1927,博莱罗克,狗,抗细菌药物（百浪多息）,1935,多麦克,小鼠,心肺旁道器,1953,葛明,猫,小儿麻痹症疫苗,1954,索尔克,恒河猴,变性脑病的病毒病原,1965,格但斯克,猩猩,心脏移植,1967,伯纳德,狗,医学科学的重大发现与动物实验的关系,45,登革病毒对新生乳鼠的致病作用,1-3,日龄乳鼠接种病毒,6,日后，小鼠陆续,出现体弱、弓背、行动迟缓等症状。,46,一、实验动物的种类和基本操作方法,（一）实验动物的种类,按微生物控制分类,普通动物（,CV,）、清洁动物（,CL,）、无特定病原体动物（,SPF,）、无菌动物（,GF,）和悉生动物（,GN,）,按遗传学控制分类,近交系、封闭群、突变系、杂交群、转基因动物,47,按微生物学控制分类,1,、,普通动物,一级动物，指不携带主要人兽共患病病原和动物烈性传染病病原的动物。,实验结果不稳定；,仅供教学示范及,作为预备试验。,48,2,、,清洁动物,二级动物，除不携带普通动物病原体外，要求,不携带对动物危害大、对实验干扰大的病原体。,适用于大多数教学和科研实验,。,49,3,、,无特定病原体动物,(SPF),三级动物，除普通动物、清洁动物不得携带的,病原体,外，还要求排除潜在感染或条件致病的,病原体,。,目前国际公认的,标准级别的实验动物,。,50,饲养管理：,SPF,动物必须饲养在温湿度衡定的空气净化,的屏障系统中，实行严格的微生物控制。,51,4,、,无菌动物和悉生动物,四级动物。,无菌动物,要求现有的检测技术在动物体内外的任何部位均检不出任何微生物和寄生虫,。,悉生动物又称,已知菌动物,，是指在无菌动物体内植入已知微生物的动物，必须饲养于,隔离系统,。,52,无菌动物,饲养条件：无菌隔离器。,第一代通过无菌手术剖腹取胎,饲养在无菌隔离器内，,人工喂乳或保姆代养培育而成。,53,悉生动物,饲养条件：无菌隔离器。,来源：人为将已知的微生物投给无菌动物，使其体内,带有已知菌，可分为单菌动物、双菌动物和多菌动物。,54,按遗传学控制分类,1,、近交系,(inbred strain),概念：又叫纯系，,经过连续,20,代以上,全同胞或亲子交配,培育的动物品系。,特点,基因型相同，表现型一致；,对外来刺激反应一致；,实验结果重复性好，可比性强。,55,56,常用近交系小鼠名称缩写,品系名,缩 写,品系名,缩 写,AKR,AK,C57BL/10,B10,BALB/c,C,C57BR,BR,CBA,CB,DBA/1,D1,C3H,C3,DBA/2,D2,C57L,L,HRS/J,HR,C57BL/6,B6,STS,S,57,C3H/He,系,BALB/c,系,C57BL,58,2,、封闭群,(closed colony),概念：也称远交群，,在不从其外部引入新个体的条件下，以,非近亲交配方式至少连续繁殖,4,代以上,生产的一个实验动物种群。,特点,群体遗传特异性相对稳定；,个体间具有杂合性，存在一定差异。,59,常用封闭群的啮齿类的实验动物,昆明（,KM,）小鼠,、,NIH,小鼠、,LACA,小鼠、,ICR,小鼠、,Wistar,大鼠,、,SD,大鼠,、,Hartley,豚鼠、大耳白兔和青紫蓝兔等。,KM,小鼠,青紫蓝兔,Wistar,大鼠,60,3,、突变系,(mutant strain),概念：由于,遗传基因发生突变,而具有某些特殊性状的动物，如肥胖症小鼠、糖尿病小鼠等。,BALB/cA-nu,1973,年丹麦的,C.W.Friis,在,BALB/cA,近交系小鼠中发现自发性突变的无毛小鼠，该突变小鼠胸腺发育不良，免疫,T,细胞缺失，而培育成了,BALB/cA-nu,。,61,突变系小鼠,SCID,小鼠,裸小鼠,62,4,、杂交群,概念：又称异系杂交，是由,不同的品系杂交,所产生的后代。由两个近交系之间交配产生的动物称为杂交一代。,特点：,杂交一代动物遗传和表型均一性好；,生命力、适应力和抗病力较近交系动物强；,实验结果重复性好，适应实验范围更大。,63,繁殖方法：,将两个用于生产杂交一代的亲本品系或种群进行交配，所得第一代即为,F1,动物。,64,5,、转基因动物与基因缺陷动物,将,外源性基因插入,生殖细胞基因组并能正常繁衍的动物称为转基因动物。,采用,基因剔除,技术构建基因缺陷动物，通过删减单一基因或相关基因组，研究基因的功能。,65,二、常用实验动物,66,（一）小鼠,近交系,BALB/c,、,C3H,、,DBA,、,C57BL,、,615,、,129,等。,突变系,nude,、,scid,、,dw,、,hr,等。,封闭群,KM,、,ICR,、,NIH,、,CFW,等。,67,1,、,昆明小鼠,(KM),远交群，基因库大，基因杂合率高。,68,2,、,BALB/c,小鼠,近交系，白化小鼠，血压较高。易患慢性肺炎。,BALB/c,白化,69,3,、裸鼠,先天性无胸腺的突变系小鼠。,裸鼠是肿瘤研究的常用模型，也可研究病毒感染与特定免疫功能的关系。,70,4,、,SCID,鼠,(severe combined immunodeficiency,SCID),体液免疫和细胞免疫严重联合缺陷的突变系小鼠。,缺乏,T,和,B,淋巴细胞免疫功能。,目前多用于病毒免疫学,和肿瘤学的研究。,71,（二）豚鼠,在免疫学和病毒学实验中豚鼠可制备补体和抗体及提供红细胞做血吸附实验等。,72,（三）家兔,免疫学和病毒学实验中常用动物。,免疫反应灵敏，血清量产生较多；对许多病毒和致,病菌非常敏感，适用于各种微生物学的研究,新西兰兔,青紫蓝兔,大耳白兔,73,三、实验动物常用基本操作技术,（一）实验动物的捕捉和固定,小鼠,74,先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉。,75,在鼠向前爬行时，,用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤。,76,将鼠体置于左手心中，把后肢拉直。,77,以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。,78,79,大鼠,80,先用右手抓取大鼠尾提起，置于鼠笼或实验台向后拉。,81,在鼠向前爬行时，用左手拇指和食指抓住大鼠的两耳和颈部皮肤。,82,以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。,如果大鼠体积太大,可由第二个人协助固定后肢。,83,84,豚鼠,85,先用手掌迅速扣住鼠背。,86,抓住其肩胛上方，以拇指和食指环握颈部，中指和无名指轻轻扣住胸廓。,87,抓住其肩胛上方，以拇指和食指环握颈部，中指和无名指轻轻扣住胸廓。,88,或像抓取大鼠一样抓住双耳和颈背部皮肤。,89,另一只手托住臀部。,90,家兔,91,按住兔子的双耳和颈背部。,92,一只手抓住兔子双耳和颈背部的毛皮提起。,93,然后另,一只手,托其臀,部，让,其体重,的大部,分集中,在这一,只手上,。,94,注意：,不能单纯抓双耳或抓提背腹部的毛皮。,95,96,将兔子放入盒式固定器内；露出头部。,97,（二）实验动物编号和分组,1,、编号：,区别实验组和对照组动物,打号法：适用于耳朵较大的动物,针刺法：适用于大小鼠、豚鼠,染色法,打孔或剪缺口法,98,染色法,3%-5%,苦味酸,溶液，可染,成黄色。,0.5%,中性红或品红,溶液,可染成红色。,99,打孔或剪缺口法,100,2,、分组,分组应按,随机分配,的原则。,每组动物数量应按实验周期长短、实验类型及,统计学要求,而定。,为了实验的科学性和客观性，实验中必须设置,对照组,。,101,（三）实验动物常用的麻醉方法,局部麻醉,浸润麻醉：,普鲁卡因,、,利多卡因,全身麻醉,乙醚吸入、,戊巴比妥钠,、,氨基甲酸乙酯,102,（四）实验动物接种途径和接种方法,皮下接种,103,腹腔接种,104,以一只手抓取和固定动物，使腹部向上，,以及使鼠头稍朝下大约15度角（头低位）。,105,用消毒酒精进行进针部位消毒。,106,另一只手将注射器针头于左（或右）小腹部刺入皮下。,107,静脉接种,108,将小鼠放进固定器里。,109,露出尾巴。,用4550的温水浸润尾部半分钟,或用酒精擦拭使血管扩张和使表皮角质软化,。,110,用食指和中指从下面托起尾巴，,以无名指和小指夹住尾巴的末梢，大拇指再轻轻按住尾部。,111,右手持注射器，使针头与静脉平行（小于30度角），从尾下四分之一处（约距尾尖2-3厘米）处进针。,112,将兔子放入固定架,113,先拔去注射部位的被毛；用手指弹动或轻揉兔耳，使静脉充盈；,用消毒酒精消毒注射部位。,114,用一只手的食指和中指托住注射部位的耳缘，大拇指顺势按在耳上面固定住兔耳。,115,另一只手持6号针头（连注射器）尽量从静脉的远端刺入。,116,当针头有回流血时，移动拇指于针头上以固定针头。,117,将药液以均匀的速度注入；或以均匀的速度抽取血液。,118,注射（采血）完毕，用消毒棉球（签）轻轻按住针眼，拔出针头。,119,用消毒棉球（棉签）压迫针眼片刻止血。,120,消化道接种,121,右手持注射器，将灌胃针插入动物口中，沿口腔顶壁和咽后壁徐徐插入食道。,122,鼻腔接种,颅内接种,角膜接种,一般性观察,动物发病症状情况观察,特殊检查,（一）接种后动物观察,123,124,（二）实验动物的标本采集,大鼠、小鼠采血,剪尾采血,眼眶采血,颈静脉、颈动脉采血,采眼球采血,125,126,豚鼠采血,耳缘切口采血,背中足静脉采血,心脏采血,家兔采血,耳缘静脉采血,耳中央动脉采血,颈静脉采血,127,尿液采集,代谢笼法,导尿法,穿刺膀胱法,反射排尿法,腹水采集,胃液的采集,胆汁的采集,胰液的采集,128,（三）实验动物的处理,处死,颈椎脱位法,心脏取血法,动静脉大量放血法,吸入法,麻醉法,无害化处理,组织管理,污水,污物,感染动物及有关材料,129,三、使用实验动物的基本原则,研究目的明确,动物选择原则,replace(,替代,),reduction(,减少,),refinement(,优化,),动物实验科研设计,原则,对照原则,重复原则,随机原则,接种物标本的制备和处理,选择含病毒较多的材料作接种物。,固体标本,：,病人、死者、野生动物及媒介昆虫等的原始标本。,液体标本,：,患者或动物的血液、脑脊液、尿液、水疱液等标本。,对于含菌标本：需用双抗处理，如鼻液、粪便等。,实验动物选择,选择接种途径,四、病毒学检验中动物实验的基本步骤,130,131,五、病毒学动物实验应注意的问题,病毒学动物实验的安全问题,实验动物自发性病毒感染对实验结果的影响,132,第三节 鸡胚和动物接种技术的应用,病毒分离,病毒鉴定,病毒性疾病发病及免疫研究,抗病毒药物和病毒疫苗效果及安全性检测,疫苗的研制,133,病毒分离方法的比较,方法,应 用 价 值,存 在 问 题,动物接种,应用最早；,方法简便；,结果易于观察,自身带病毒；,有的接种后不敏感；,动物饲养问题,鸡胚培养,来源客观，易于管理，带病毒机会少；多途径接种,敏感病毒谱窄,细胞培养,应用广泛，敏感病毒谱广,设备技术要求条件高,134,The end,