基因工程原理与技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,.,*,第五章 聚合酶链式反应,(polymerase chain reaction，PCR),PCR,是体外快速扩增目标DNA序列的技术,1971年Khorana等,提出“在体外经DNA变性，与适当引物杂交，再用DNA聚合酶延伸，克隆DNA”的设想。,1983年Mullis,发明了PCR技术。,1988年Saiki等,将耐热Taq DNA聚合酶引入了PCR技术,。,1989年PCR被美国Science杂志列为十余项重大科学发明之首。,1993年Mullis,荣获诺贝尔化学奖。,应用领域,：,生命科学、医学、法医学及考古学。,.,第一节 PCR原理,遵循DNA体内复制原理，半保留式扩增；,扩增序列取决于设计一对引物(,正向引物,、,反向引物,)，有效扩增长度为2kb左右；,扩增循环包含,变性,、,退火,、,延伸,3个阶段；,3035个循环后，目标序列呈指数级扩增(2,n,-,2,),Cycle#1,.,第二节,PCR,反应体系,一、反应体系,20,l,反应体系,10buffer,(Tris-HCl、KCl、Tween20、明胶、牛血清蛋白),dNTP,(各20200,mol/L),模板DNA,(0.12,g=10,5,个分子),引物,(各20200pmol),MgCl,2,(0.52.5mmol/L),Taq,DNA聚合酶,(12.5U),无菌ddH,2,O,.,二、反应参数,预变性：94 35 min,变性：94 3060 S,退火：3865 3060 S,延伸：72 12 min,终延伸：72 10min,3035次循环,.,三、影响PCR的因素,1、,反应成分,引物,；浓度、长度,DNA聚合酶,；种类(Klenow酶、,Taq,酶、,Pfu,酶)、用量,dNTP,；浓度、比例,Mg,2+,；影响,Taq,DNA聚合酶的活性和真实性、引物退火、模板解链温度、产物的特异性、引物二聚体生成等。,反应缓冲液,；pH8.3，KCl能促使引物退火、但浓度大于50mmol/L抑制酶活性。,模板DNA,。用量，线性DNA扩增效果大于环状DNA。,.,2、,反应条件,变性的温度和时间,；,热启动,降低非特异性扩增,退火的温度,和时间,；取决于引物的长度、浓度和碱基组成，退火温度为,Tm,-,5。,退火温度越高，扩增特异性越高。,延伸温度和时间,。,延伸时间长短取决于目标序列的长度、及延伸温度的高低。对2 kb长目标序列扩增时间多采用 1min(72 时)。,.,四、平台效应,平台效应,是指PCR反应后期扩增产物不再随循环次数而明显上升、反应曲线,变得平坦,的现象。,.,引起平台效应的因素,：,dNTP或引物等消耗殆尽；,酶活性逐渐降低；,最终产物的阻化作用(焦磷酸盐、双链DNA)；,非特异性产物与模板的竞争作用；,在高产物浓度下产物变性不完全；,低浓度的非特异产物开始大量扩增。,PCR的特点,：,灵敏度高,简便、快速,对样品纯度要求低,.,第三节 聚合酶链式反应引物设计原则,一、引物设计的总原则,提高特异性扩增，降低非特异性扩增,。,二、引物设计的一般原则,引物长度应为1530个核苷酸,，Tm接近72较佳；,Tm(GC)4(AT)2,引物中碱基分布应是随机的,，避免出现一连串单一碱基以致产生二级结构；,GC碱基的含量在 4555左右,；,引物3端必须与模板互补,，5端可以不互补,引物中连续互补碱基应小于4个,；,引物间连续互补碱基应小于4个,。,.,三、引物3端的末位碱基,引物3端的未位碱基：优选A，其次是G、C，不要选T。,因为当未位碱基为T时，即使在错配的情况下也能引发链的合成；而未位碱基为A时，错配时的引发效率大大降低；若为G或C，则引发率居于其间。当然，设计,简并引物,时，3端末位碱基选T会得到较好的效果。,四、引物设计软件,Oligo6.57,Primer 5.0,.,第四节 PCR的类型,一、已知DNA序列的PCR扩增,1、巢式PCR,不受平台效应限制，扩增灵敏度增加1000倍，,引物1,引物2,25个循环,引物3,引物4,25个循环,.,2、热巢式PCR,第二对引物之一标记放射性物质，电泳检测时灵敏度增高，可测出10,6,个细胞中的一个 DNA分子。,3、半巢式PCR,(,见下图,),引物1,引物2,25个循环,25个循环,引物1,引物3,.,4、不对称PCR,采用两种不同浓度的引物(50:1)。,主要用于,制备DNA测序的,单链,模板,以及,制备杂交探针,。,高浓度引物,低浓度引物,.,5、等位特异性PCR,用于检测点突变,。在引物的 3端设计了突变碱基，突变引物与正常模板间扩增受阻，电泳分析时，不出现谱带，反之则会出现特定谱带。但有些错配碱基不能完全阻止引物延伸。,6、竞争引物PCR,用于,检测特定位点的点突变,。设计两个等位特异性引物，一个是正常的，另一个是突变引物，而且,突变碱基在引物中间,，,其扩增产物相差,20,倍以上。由于,一个引物被标记,，能检测出不同样品的的扩增差异。,常为A/A、G/G、G/A、C/A、C/C、T/C、T/G。,.,7、降落PCR,在一次PCR中，设计多循环反应的程序，第一个程序的退火温度高于Tm，以后每个程序的退火温度逐渐降低，确保第一次扩增的特异性，这样后面的低退火温度不会影响扩增的特异性，因为在开始的几个循环中，目标产物已指数级扩增。常用于,根据氨基酸序列设计简并引物的扩增、多基因家族成员的扩增,。,.,二、逆转录PCR(,RT-PCR,),逆转录PCR是指先以mRNA，以oligo(dT)n为引物在逆转录酶作用下合成cDNA第一链，然后用已知一对引物扩增cDNA片段的技术。,主要用于,基因表达,、,cDNA克隆,、,逆转录病毒鉴定,等研究。,反转录,PCR,.,RT-PCR 引物设计原则：,引物限定区最好为180500bp；,引物5和3端不应存在回文序列结构；,用oligo(dT)n作逆转录第一链cDNA的引物时，有义引物应尽量位于RNA的3端；,在引物限定区内，基因组DNA最好有一内含子，这样可检测污染情况；,PCR引物限定区内最好有一酶切位点，以便鉴定产物；,.,三、快速扩增cDNA末端(,RACE,，,锚定PCR,),杂合引物,:17nt oligo(dT)(,锚定引物,)+带限制酶位点的序列。,基因特异引物,5RACE的缺点：,不能获得真正的5末端,。因为过早终止第一链cDNA像全长cDNA一样，可被末端转移酶同样有效地加尾。,3RACE,5RACE,.,新5RACE,(,加帽法,),杂合引物RNA、RNA连接酶,5RACE,烟草酸性焦磷酸酶,.,四、已知序列的侧翼未知序列的PCR扩增,1、,反向PCR,酶切位点,已知序列,酶切,稀释并分子内连接,引物,PCR,在已知序列内酶切,PCR,.,2、锅柄PCR,酶切、磷酸酶处理,连接单连引物,加Taq酶和dNTP，变性,链内复性（稀释）,链延伸,链延伸,巢式PCR,已知序列,引物,巢式PCR,.,五、未知序列PCR扩增,1、差异显示PCR,锚定引物,N,9,：随机引物,.,2、减法PCR,例如：受试者为感病材料；驱动者为正常材料,.,六、荧光定量PCR,(,实时定量PCR,),荧光染料(EB)：结合双链DNA会使荧光增强，但结合无特异性。,荧光标记探针,(见图)：利用Taq酶的外切酶活性，扩增时切断探针释放出荧光基团，使荧光增强。特异性强,用途,：,检测病原菌,、基因表达。,R：,荧光基团,；Q：,淬灭基团,.,第五节 PCR技术应用,一、,基因克隆及筛选,二、,基于PCR分子标记,RAPD、SSR、AFLP等，应用在遗传图谱构建、生物进化、遗传多样性等方面的研究。,三、,DNA测序,四、,突变检测,五、,基因表达检测,六、,病原菌检测与疾病诊断,七、,法医鉴定,犯罪嫌疑人鉴定,(,见下图,)、,亲子鉴定,八、,转基因检测,转基因育种,、,进口农产品,九、其它,.,1.5.9.Marker，8是对照,2.嫌疑人A血细胞DNA,3.被害人衣服上残留精液DNA,4.嫌疑人B血细胞DNA,6.被害人阴道取样DNA,7.被害人血DNA,8.实验对照,.,