SN∕T 3170-2012 葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法.pdf
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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱 犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犡 狔 犾 犲 犾 犾 犪犳 犪 狊 狋 犻 犱 犻 狅 狊 犪 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位: 中华人民共和国北京出入境检验检疫局、 中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人: 邓丛良、 张凯、 高文娜、 吕玉峰、 梁新苗、 刘鹏。犛 犖犜 葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法范围本标准
2、规定了进境植物检疫中葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进境植物苗木、 繁殖材料和植物产品的葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 植物病毒免疫电镜检测方法原理 葡萄皮尔斯病菌的分类地位葡萄皮尔斯病菌学名犡 狔 犾 犲 犾 犾 犪 犳 犪 狊 狋 犻 犱 犻 狅 狊 犪 , , 该菌属原核生物界( ) , 薄壁菌门( ) , 木质部小菌属(犡 狔 犾 犲 犾 犾 犪) 。 检疫鉴定依据以病菌在寄主上的症状特点、 病菌形态学特
3、征及其培养特性、 病菌种的特征以及基因组序列作为葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定依据, 必要时辅助进行致病性测定( 参见附录 ) 。仪器设备、 试剂及用具 仪器、 设备、 用具超净工作台、 生物培养箱、 电子天平、 酶标仪、 仪、 凝胶成像仪、 水浴锅、 高速冷冻离心机、 高压灭菌锅、 透射式电子显微镜、 冰箱、 液氮罐、 解剖刀片、 白磁盘保湿盒、 研钵、 微量移液器( 可调式范围: ) 、 吸头( 、 、 ) 、 离心管( ) 、 管、 酶联板。 试剂和培养基检验所需的药品均为分析纯。检验中用到的试剂琥珀酸 柠檬酸 磷酸盐缓冲液, 其配制方法见附录。检验中用到的 培养基、 培养基、 培养基、 培养
4、基, 其配制方法见附录。葡萄皮尔斯病菌的鉴定 双抗体夹心酶联免疫吸附(犇 犃 犛 犈 犔 犐 犛 犃) 检测利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法对样品进行初筛( 见附录) , 若检测结果为阳性, 需进行病原犛 犖犜 菌的分离培养或者 方法检测。 葡萄皮尔斯病菌的分离、 培养和鉴定 葡萄皮尔斯病菌的分离培养 植物样品叶片中葡萄皮尔斯病菌的分离培养:)叶片表面用 次氯酸钠溶液消毒 , 然后用无菌水漂洗次;)用无菌刀片切下叶片的中脉和叶柄, 切出一个 的截面, 将汁液划线到 或 培养基上( 柑橘叶片将汁液划线到 或者 培养基上) ;)划线后的平板放在塑料袋中于 生物培养箱中培养。 植物样品根或者茎中葡萄
5、皮尔斯病菌的分离培养:)取根或茎用 次氯酸钠溶液消毒 , 然后用无菌水漂洗次;)用解剖刀将根或茎切割长为 , 直径 的小段。然后用琥珀酸 柠檬酸 磷酸盐缓冲液进行真空渗透;)真空渗透提取物( 每个样品 ) 在 下离心 ;)离心后的沉淀用 的琥珀酸柠檬酸磷酸盐缓冲液悬浮, 取一滴() 滴到 或 培养基上( 柑橘用或者 培养基上) ;)平板在 中培养, 将平板放在塑料袋中防止培养基干燥。 葡萄皮尔斯病菌的菌落特征葡萄皮尔斯病菌在 培养 之后可以看到分离的菌落。菌落直径一般为 , 圆形, 完整的边缘和表面凸起; 有时候形成的菌落具有波浪形的边缘, 表面扁平。 葡萄皮尔斯病菌的电镜观察按 的规定进行电
6、镜观察。 葡萄皮尔斯病菌犘 犆 犚检测用 对病原菌进行检测的方法见附录 。结果判定酶联测定为阳性后, 经 检测待测样品的序列与 中已知的葡萄皮尔斯病菌同源性为 或者分离培养性状结合电镜观察为阳性即可判断为葡萄皮尔斯病菌。样品保存与复核 样品保存葡萄皮尔斯病菌为检疫性有害生物, 应做好以下准备, 并在周内接受复核。病菌要有活体样品存在, 其他实验样品应妥善保存于冰箱中, 以备复核。 结果记录与资料保存完整的实验记录包括: 样品的来源、 种类、 时间, 实验的时间、 地点、 方法和结果等, 并要有经手人和犛 犖犜 实验人员的签字。酶联测定需有酶联检测结果的原始数据, 检测需有电泳结果图片。 复核必
7、要时由专家进行复核。犛 犖犜 附录犃( 资料性附录)葡萄皮尔斯病菌相关材料犃 学名犡 狔 犾 犲 犾 犾 犪 犳 犪 狊 狋 犻 犱 犻 狅 狊 犪犠 犲 犾 犾 狊 犲 狋犪 犾 木质部难养细菌。犃 英文名 ( ) 。犃 分类地位薄壁菌门( ) 木质部小菌属(犡 狔 犾 犾 犲 犾 犪) 木质部难养菌(犡犳 犪 狊 狋 犻 犱 犻 狅 狊 犪)犃 分布主要分布于法国、 意大利、 前南斯拉夫、 印度、 哥斯达黎加、 加拿大、 墨西哥、 美国、 阿根廷、 巴西、 巴拉圭、 委内瑞拉和南斯拉夫。我国台湾也有报道。犃 寄主宽皮橘( 松橘) 、 甜橙( 黄果、 广橙) 、 莴苣、 毒参属、 茜草科等
8、种植物。犃 主要症状侵染葡萄初期沿叶片边缘出现微黄色或红色病斑, 后期病斑形成同心轮纹状, 叶片干枯死亡。症状因品种而异, 在黑皮诺和赤霞珠品种上, 沿叶片边缘形成规则、 边缘逐渐褪色的病斑; 在无核白、 西万尼和白诗南品种上, 在叶脉间组织形成褪色的病斑。早秋时叶片干枯脱落, 只留下叶柄挂在茎蔓上。枝条: 感病新梢推迟老化成熟, 枝蔓表面形成“ 绿岛” 症状的病斑。如果当年没有明显症状, 在次年春天也会出现生长延迟和矮化的现象。果实: 发病果实一般停止生长, 逐渐枯萎, 有的病果可能提前着色, 但并不成熟。在感病第一个季节末期, 通常只有个个枝蔓出现明显病状, 随着病情发展逐渐沿蔓扩展向根部
9、发展, 整个植株长势变弱, 症状逐渐明显。到了中期, 感病枝蔓上的一些或全部枝蔓萎蔫干枯, 枝蔓顶端和根可能全部死亡。葡萄感病第年, 一些枝蔓或短果枝会不发芽。有的枝蔓从月末到夏季, 可能正常发芽, 但全部新生枝条生长缓慢, 新叶叶脉间出现黄化。老叶出现萎缩, 在夏季末, 叶片边缘出现灼伤症状, 果穗皱缩干枯。犃 病原病原是一种细小的革兰氏阴性细菌, 具有数层卷绕的细胞壁和胞外纤维束。电镜下观察该菌为杆犛 犖犜 状, 大小为( )() 单生, 无鞭毛, 革兰氏染色为阴性, 细胞壁波纹状, 无芽孢。具有波纹状细胞壁是这种细菌的典型特征。该细菌兼性好气性, 对营养要求苛刻, 在琼脂上不能生长, 生
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