SN∕T 3398-2012 大豆检疫性病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法.pdf
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1、书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准? ? ? ? ? ? ? ?大豆检疫性病毒多重实时荧光? ? ? ? ? ?检测方法? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?发布? ? ? ? ? ? ? ? ? ?实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书?中华人民共和国出入境检验检疫行业标准大豆检疫性病毒多重实时荧光 ? ? ? ? ? ?检测方法? ? ? ? ? ? ?
2、 ?中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲?号? ? ? ? ? ?北京市西城区三里河北街? ?号? ? ? ? ? ?总编室? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?网址? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷?开本? ? ? ? ? ? ? ?印张? ? ?字数? ?千字? ? ? ?年?月第一版? ? ? ?年?月第一次印刷印数? ? ?书号? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?定价 ? ? ? ? 元书书书前?言?本标准按照? ? ? ? ? ?给出的规则起草?本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口?本标准起草单位? 中
3、华人民共和国深圳出入境检验检疫局? 深圳市检验检疫科学研究院?本标准主要起草人? 郑耘? 章桂明? 冯建军? 卢小雨? 汪莹? 李一农? ? ? ? ? ? ? ?大豆检疫性病毒多重实时荧光? ? ? ? ? ?检测方法?范围本标准规定了烟草环斑病毒? 南芥菜花叶病毒? 番茄环斑病毒? 南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒的多重实时荧光 ? ? ? ? ? ?检测方法?本标准适用于大豆及其加工产品中上述五种病毒的检测?规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的?凡是注日期的引用文件? 仅注日期的版本适用于本文件?凡是不注日期的引用文件? 其最新版本? 包括所有的修改单? 适用于本文件? ?
4、 ? ? ?进出境植物及植物产品检疫抽样?术语和定义下列术语和定义适用于本文件? ?逆转录 ? 聚合酶链式反应? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?逆转录 ? 聚合酶链式反应? 简称? ? ? ? ? ? 在适宜的反应条件下? 以样品中抽提出的? ? 为模板? 逆转录酶在适宜的反应条件下? ? 被逆转录成? ? ? 再以? ? ? 为模板进行? ? ?扩增? ?多重实时荧光? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
5、? ? ? ? ? ? ?依据荧光信号随着? ? ? ? ? ?产物数量增加而同步放大的原理? 在? ? ? ? ? ?扩增的过程中? 同时连续监测反应体系中不同标记的多种病毒扩增片段荧光信号的变化? 根据荧光信号基线的平均值和平均标准差? 得出大于平均值的荧光值即阈值? 收集荧光信号增强到预定阈值时的? ? ?循环次数? 即? ?值?根据多种病毒荧光信号的? ?值判断样品是否带有该多种检疫性病毒?原理采用多重实时荧光? ? ? ? ? ?方法检测烟草环斑病毒? 南芥菜花叶病毒? 番茄环斑病毒? 南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒? 参见附录 ? ?仪器设备和用具烘箱? 高压灭菌锅? 水浴锅?
6、低温冰箱? 纯水仪? 高速冷冻离心机? 实时荧光? ? ?仪? 微量移液器? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 旋涡振荡器? 超净工作台? 电泳仪? 水平电泳槽? 凝胶成像仪? 各种吸头? ? ? ? ? ? ? 离心管? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?主要试剂主要试剂和缓冲液参见附录?取样方法样品取样方法按照? ? ? ? ?执行?样品的制备? ?种子类随机抽取? ? ?粒种子? 将其分为五组? 在适宜的发芽温度? ? ? 条件下催芽? 直至长出第一对真叶?随机抽取? ?株苗叶片? 每株取?叶片? 制备成一个样品? ?苗木类将繁殖材料种植在隔离温室中? 于? ? ?生长
7、并观察症状?取?表现症状和无症状植株的叶片? 或花芽? ? 制备成一个样品? ?鳞球茎类将至少? ?个? 头? 鳞球茎或块茎芽眼? 处于休眠状态的还要打破休眠? 在生物培养箱? ? ?中催芽? 直至长出叶片?随机抽取?叶片? 制备成一个样品?五重实时荧光? ? ? ? ? ?检测反应中空白对照为双蒸水? 阴性对照为不含有五种病毒的 ? ? 阳性对照为含有五种病毒的? ? 待测样品的 ? ? 为模板? 每个样品重复三次?具体操作过程参见附录? ?结果判断及表述? ? ?实时荧光 ? ? ? ? ? ?在阳性对照? ?值小于? ? ? 水空白对照 ? ?值等于? ? ?的条件下? 若不满足该两项条
8、件? 此次检测无效? 应重做荧光? ? ?扩增? ?待测样品中标记为烟草环斑病毒? 南芥菜花叶病毒? 番茄环斑病毒? 南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒的荧光信号的? ?值为? ?时? 则判定未检测到病毒?待测样品中标记为烟草环斑病毒? 南芥菜花叶病毒? 番茄环斑病毒? 南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒的荧光信号的? ?值小于或等于? ?时? 则判定检测到该病毒或该几种病毒?待测样品中标记为烟草环斑病毒? 南芥菜花叶病毒? 番茄环斑病毒? 南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒的荧光信号的? ?值小于? ?而大于? ?时? 应重新进行测试? 如果重新测试的 ? ?值为? ?时? 则判定未检测到病毒?
9、如果重新测试的 ? ?值小于? ?而大于? ?时? 则判定检测到该病毒或该几种病毒? ? ? ? ? ? ? ? ? ?结果表述检出结果表述如下?检出烟草环斑病毒或未检出烟草环斑病毒?检出番茄环斑病毒或未检出番茄环斑病毒?检出南方菜豆花叶病毒或未检出南方菜豆花叶病毒?检出南芥菜花叶病毒或未检出南芥菜花叶病毒?检出菜豆荚斑驳病毒或未检出菜豆荚斑驳病毒? ?样品原始数据保存? ? ?样品保存经检测确定携带烟草环斑病毒? 南芥菜花叶病毒? 番茄环斑病毒? 南方菜豆花叶病毒和菜豆荚斑驳病毒的样品干燥后在? ?冰箱保存?年?在繁殖材料中发现上述病毒的? 采集叶片? 花芽等病毒浓度较高的材料干燥处理保存?
10、检测原始记录? 照片等文档按有关规定做好登记? 标记和存档? 以便必要时复核? ? ?原始数据保存完整的实验记录包括? 样品的来源? 种类? 登记时间? 实验地点? 检测方法和结果等? 并要有经手人和实验人员的签字?实时荧光 ? ? ? ? ? ?检测应有实时荧光结果图片? ? ? ? ? ? ? ?附?录? 资料性附录?五种检疫性病毒的生物学特性? ?烟草环斑病毒烟草环斑病毒? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 为豇豆花叶病毒科? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 线虫传多面体病毒属? ? ? ? ? ? ? ? ? 的成员? 病毒粒子为球
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