NY∕T 3281.1-2018 病毒微生物农药 小菜蛾颗粒体病毒 第1部分:小菜蛾颗粒体病毒悬浮剂(农业).pdf
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1、ICS 65.100 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3281.1一2018病毒微生物农药小菜峨颗粒体病毒第1部分:小菜峨颗粒体病毒悬浮剂Viral based insecticides 一.plz切ut,印d胁t缸x砂ylostdt归agranulovir.庐咄.Part 1 :Pll切ut,印el缸lxylostell granulovirus suspension concent仕ra创te叫(SC)2018-07-27发布2018- 12 -01实施中华人民共和国农业农村部发布刚昌NY/ T 3281病毒微生物农药小菜峨颗粒体病毒拟分为如下部分:一一第1部分:小菜峨
2、颗粒体病毒悬浮剂;本部分为NY/T3281的第1部分。本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。NY/T 3281. 1-2018 本部分起草单位:农业农村部农药检定所、中国科学院动物研究所、河南省济源白云实业有限公司。本部分主要起草人:张寰、王晓军、方分分、陈立萍、王红托、秦启联、郭明程。I 范围病毒微生物农药小菜峨颗粒体病毒第1部分:小菜峨颗粒体病毒悬浮剂NY/T 3281. 1-2018 包装、储运、安全和保质期。2 规范性引用文件下列文件对件。凡是不注日期GB/ T 1601 GB/ T 1604 GB/ T 1605 GB 3796
3、GB 4789.2 GB 6682 GB/ T 8170 GB/ T 1482 GB/ T 1615 GB 20813 GB/ T 28137 GB/ T 31737 3 术语和定义下列术语和定3.1 小菜峨颗粒体病毒悬浮荆以小菜峨颗粒体病毒母药与3.2 病毒包涵体occlusion body (OB) 工而成的颗粒体病毒病毒水平传播的主要载体形式,其结构特征是病毒粒子包埋于蛋白质基质的包涵体中。3. 3 生测效价比potency ratio 根据药物的药理和对生物体的作用设计试验,比较样品、标准品引起的生物反应,测定药物效价或其生物学活性。3.4 菌落形成单位colony fonning u
4、nits( CFU) 由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落。指在琼脂平板上经过NY/T 3281. 1-2018 一定温度和时间培养后形成的每一个菌落,是计算细菌或霉菌数目的单位。3.5 杂菌菌落总数number of microbial contaminants 将小菜峨颗粒体病毒悬浮剂样品稀释后涂布在琼脂营养培养基上,所得到的微生物(真菌和细菌)菌落数之和。4 要求4. 1 外观应是可流动、易测量体积的悬浮液体;存放过程中可能出现沉淀,摇匀应恢复原状,不应有结块。4.2 指标小菜峨颗粒体病毒悬浮剂还应符合表1的要求。表1小菜峨颗粒体病毒悬浮剂控制项目指标项目指标
5、病毒包涵体数量,OB/mL二三标不值生测效价比(标准品LC;o/待测样品LC;o),%二三80.0杂菌菌落总数,CFU/mL1.0XIO pH 5. 07. 5 悬浮率,%二三80.0 细度(通过75m标准筛),%二三95.0 |倾倒后残余物,%王三3.0倾倒性|洗涤后残余物,%O. 5 持久起泡量(1min后),mL王三30.05 试验方法5. 1 一般规定除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,所述溶液均为水溶液,试验用水为GB/T6682中规定的三级水。5. 2 抽样按照GB/T1605中液体制剂采样方法进行。用随机数表法确定抽样的包装件,最终抽样量应不少于200mL。5. 3 毒种鉴别
6、毒种鉴别使用显微镜镜检与生物测定相结合的方法。通过显微镜镜检的方法确定试样病毒为颗粒体类病毒。取试样适量,用蒸馆水制成浓度大于2X1070B/mL的病毒悬浮液,在显微镜下物镜使用油镜(放大100倍)观察,显示有很多小颗粒作布朗运动(元规则热运动),验证该病毒为颗粒体类病毒。通过生物测定的方法确定试样为小菜峨颗粒体病毒。依次测试小菜峨、棉铃虫、甜菜夜峨3种幼虫。取上述病毒悬浮液,均匀涂布在人工饲料上,晾干后饲喂2龄小菜峨幼虫或者棉铃虫、甜菜夜娥幼虫,并设置蒸馆水对照,重复3次。每处理用虫90头(30头X3),环境温度控制在(26士l)OC、湿度40%以上。试验后第2d开始观察小菜峨的死亡情况,统
7、计至第7d,计算其校正死亡率。小菜峨幼虫感病症状:虫体体色乳白,体节膨大,行动缓慢,其感病特征非常明显。小菜峨校正死亡率应达到80%以上,而棉铃虫、甜菜夜峨的校正死亡率小于20%。依此可以确定上述病毒为小菜峨颗粒体病毒。小菜峨颗粒体病毒有效成分描述参见附录A。仪器设备、试剂材料、测定步骤等按照附录B的规定执行。5. 4 定量检测NY/ T 3281. 1-2018 5.4. 1 细菌计数板法5. 4. 1. 1 方法提要小菜峨颗粒体病毒包涵体的含量采用细菌计数板计数法测定。取试样适量,用O.l%SDS稀释适当倍数,获得悬浮液,滴加在细菌计数板上在光学显微镜下计数。根据细菌计数板上病毒包涵体的数
8、量以及稀释倍数,计算出单位质量(体积)病毒的数量。5.4. 1.2 仪器、设备光学显微镜(物镜具备油镜镜头)。细菌计数板。微量移液器:1LlmL。容量瓶:100mL。5.4. 1.3 测定步骤町的渗O板缓川U数缓。计行P菌h人,一5.4.1.3.2 镜下观察2各5个中方格(1) 式中:Xj A B 2X 107一-lmL80 计数/5.4. 1.5 允许误差病毒包涵体含量2次5. 4. 2 荧光定量PCR法小菜峨颗粒体病毒属单粒包埋型病毒,包涵体数目。荧光定量PCR分析法,是通过已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。本方法根据小菜峨颗粒体病毒基因组的单拷贝基因中保守区域设计引物,构建
9、含有目的基因质粒作为标准品,绘制标准曲线。通过荧光定量PCR的方法获得上述单拷贝基因的拷贝数,通过计算获得基因组的拷贝数,进而推算出颗粒体病毒包涵体的数目。仪器设备、试剂材料、测定步骤等具体参照附录C的规定执行。5. 4. 3 生测效价比的测定病毒试样使用蒸锢水稀释,获得特定浓度的待测病毒悬浮液,均匀涂布在人工饲料上,晾干后饲喂小菜峨、棉铃虫和甜莱夜峨幼虫,重复3次。环境温度控制在(26:1:1) .C、湿度40%以上。统计2d7 d 幼虫的死亡情况,计算校正死亡率。3 NY/T 3281. 1-2018 仪器设备、试剂材料、测定步骤等具体按照附录D的规定执行。5. 5 杂菌菌落总数的测定按G
10、B4789.2的规定执行。5.6 pH的测定按GB/T1601的规定执行。5. 7 细度的测定按GB/T16150-1995中2.2的规定执行。5. 8 倾倒性试验按GB/T31737的规定测定。5. 9 悬浮率的测定按GB/T14825的规定执行。按5.4规定方法测定试样和剩余的1/10悬浮液中的小菜峨颗粒体病毒量,计算其悬浮率。5.10 持久起泡量试验按GB/T28137的规定测定。6 产品的检验与验收应符合GB/T1604的规定。极限数值处理采用GB/T8170中的修约值比较法。7 标志、标签、包装、储运、安全和保质期7. 1 标志、标签应符合GB3796和GB20813的规定,注明低毒
11、防曝晒川防高温等标志。7. 2 包装应符合GB3796和GB20813中的有关规定。7. 3 储运储运过程中应有遮避装置,严防日晒和潮湿。7. 4 安全在使用说明书或包装标签上,除有相应的毒性标志外,还应有毒性说明、中毒症状、解毒方法和急救措施。7.5 保质期在规定储运条件下,小菜峨颗粒体病毒悬浮剂的质量保证期从生产日期算起为2年。2年保质期内,生测效价比和病毒包涵体数量不低于4.2指标。4 附录A(资料性附录)小菜峨颗粒体病毒有效成分描述A. 1 中文通用名称小菜娥颗粒体病毒。A.2 拉丁文学名A.3 生物学分类A. 4. 2 分子结杆状病毒基A. 4. 3 包洒体生包涵体可以壤中可以存活多
12、年。成。本产品对低毒。病毒包涵体经害虫取食叶织,导致害虫染病后组织细胞液化而亡,昆虫病毒病,药效持久。A.6 有效成分主要存在形态小菜峨颗粒体病毒包涵体。A.7 生物活性杀虫。A.8 溶解性不溶于水,溶于弱碱。NY/T 3281. 1-2018 长约,急剧吞噬消耗虫体组虫之间继续传播,形成流行性5 NY/T 3281. 1-2018 A.9 稳定性在4.C以下可以长期保存,加工过程中处理温度不得高于60.C,在弱碱溶液、100.C以上高温条件下极快丧失生物活性。见光易丧失生物活性。6 NY/T 3281. 1-2018 附录B(规范性附录)生物测定法鉴别小菜峨颗粒体病毒毒种B.1 试剂和材料标
13、准品:小菜峨颗粒体病毒CPlutella xylostella Granulovirus) ,2. 0 X 1012 OB/ mL。供试昆虫:小菜峨CPlutellaxylostella) ,棉铃虫CHelicover户aarmigera),甜菜夜峨(句odoteraex-igua) ,使用人工饲料饲养。酵母粉。大豆粉:烤熟后磨碎过60目筛。大麦粉:过60目筛。番茄酱。玉米粉。纤维素粉。维生素C。10%甲醒溶液。山梨酸。对起基苯甲酸甲醋。琼脂粉:凝胶强度大于300g/ cm2。PBS缓冲液Co.01 mol/L,pH 7.4):称取NaC18.0 g、Na2HP04 1. 44 g、KH2P0
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