大片吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆表达和免疫原性分析.pdf
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1、姚文浩,吴兴隆,秦志博,等 大片吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆表达和免疫原性分析 畜牧与兽医,():,(),():大片吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆表达和免疫原性分析姚文浩,吴兴隆,秦志博,李文豪,朱惠丽,王磊,胡建和,韩艳辉(河南科技学院,河南 新乡)摘要:磷酸丙糖异构酶()是生物体糖酵解的一种关键酶,对大片吸虫获取能量而赖以生存有着十分重要的作用。本试验根据肝片吸虫(:)的基因序列,设计带有 和 作为酶切位点的引物,以大片吸虫的 为模板,扩增大片吸虫磷酸丙糖异构酶()基因。结果:基因开放阅读框为 ,编码 个氨基酸,理论等电点 为 ;构建的重组表达质粒 ()成功在大肠杆菌中表达,重组蛋白的分子量
2、约为 ;重组蛋白免疫 小鼠,收取多克隆抗体,检测结果显示,能诱导较高的 抗体水平;用感染大片吸虫动物的血清检测重组蛋白的免疫原性,分析表明,重组蛋白 具有良好的免疫原性;生物信息学预测显示,主要以 螺旋和 折叠为主,转角较少,有 个较长的无规则卷曲;通过 磷酸甘油脱氢酶偶联法测定其活性,发现 酶促反应最佳 值为 ,最适温度为 。本试验结果为深入研究 的生物学功能、评价其作为抗大片吸虫病疫苗候选分子奠定了基础。关键词:大片吸虫;磷酸丙糖异构酶;克隆;表达;酶活性分析中图分类号:文献标志码:文章编号:(),(,):(),:(),(),:;片形吸虫病是大片吸虫()和肝片吸虫()寄生于反刍动物和人的收
3、稿日期:;修回日期:基金项目:国家重点研发计划项目();中原科技创新领军人才项目()第一作者:姚文浩,男,学士通信作者:韩艳辉,博士,讲师,主要研究方向为人兽共患寄生虫病学,:。肝脏、胆管中引起的一种人兽共患寄生虫病。片形吸虫病是一种食源性寄生虫病,人类是偶感宿主,通过饮用受污染的水或水生植物而感染。该病影响全球超过 个国家的 万人,感染了全球数百万反刍动物,每年造成超过 亿美元的经济损失。近年来,农田灌溉面积扩大、湿地改造等人为活动使片形吸虫病的感染率呈上升趋势,世界卫生组织将其归类为一种被忽视的热带疾病。目前,三氯苯畜牧与兽医 年 第 卷 第 期达唑()是治疗片形吸虫病的首选药物,然而过度
4、使用会导致耐药性的产生,荷兰、智利、土耳其和秘鲁等地均出现了抗 虫株,这对该病的预防和控制产生了巨大影响,开发新的抗片形吸虫病疫苗候选分子迫在眉睫。大片吸虫主要依赖糖酵解获取能源赖以生存,而磷酸丙糖异构酶()是糖酵解过程中必不可少的酶,它可以将磷酸二羟丙酮转化为 磷酸甘油醛。作为糖酵解的关键酶,广泛存在于各类生物中,科学家已从多种生物体中克隆并成功表达出该基因。有研究显示,可用于开发药物或疫苗,不仅用于克服华支睾吸虫病,还包括其他人畜共患的蠕虫病。目前,对大片吸虫 ()的研究微乎其微。本试验以大片吸虫的 为研究对象,对该基因的生物学特性进行了初步分析,为评价其作为抗大片吸虫病疫苗候选分子的潜在
5、能力,以及深入研究 的生物学功能奠定基础。材料与方法 菌种、质粒、实验动物大肠杆菌、()、表达质粒 ()和大片吸虫 模板均由河南科技学院动物科技学院实验室保存;周龄 级 雄性小鼠购自河南斯克贝斯生物有限公司。主要试剂和酶 凝胶回收试剂盒(离心柱型)、高纯度质粒 小提试剂盒(离心柱型)、限制性核酸内切酶、载体、连接酶、标志物均购自 生物工程(大连)有限公司;异丙基硫代半乳糖苷()购自北京全式金生物技术有限公司;购自美国 公司。酶活性测定试剂均购自北京索莱宝科技有限公司。引物的设计与合成参照 收录的肝片吸虫基因()核苷酸序列,通过软件设计含有限制性酶切位点和 的引物,引物由 生物工程(大连)有限公
6、司合成。目的基因的克隆以大片吸虫的 为模板,进行 扩增。预变性 ;,个循环;延伸 ,保存。凝胶电泳鉴定并回收目的片段。目的片段与 连接过夜,按照转化说明书将连接产物转化入 感受态细胞中,培养过夜,挑取单克隆,鉴定并测序。基因的序列测定及生物信息学分析对鉴定正确的质粒进行生物信息学分析。用 软件进行基因序列分析,并进行序列相似性比较。运 用 在 线 网 站(:)对 蛋白序列进行亲疏水性分析,并在网站(:)上进行参数分析,最后利用在线网站(:)预测其三级结构。运用 软件分析 的蛋白分子量和理论等电点()。重组质粒 ()的构建对 中的测序正确样品提取质粒,并进行双酶切,并与双酶切的 ()质粒 连接过
7、夜,构建重组表达质粒 ()。重组质粒在大肠杆菌中的表达与表达产物的纯化 按照转化说明书将 中的连接产物转化入大肠杆菌 ()感受态细胞中,经 扩增、酶切及测序鉴定正确后,大量扩增,并进行诱导表达。获得可溶性重组蛋白,用 进行蛋白的纯化,验证纯化效果。动物免疫与免疫血清制备选择 周龄 级 小鼠 只,随机分成 组,分别为免疫组()、佐剂对照组()和空白对照组()。免疫组每次每只注射 含 佐剂和 纯化的重组蛋白 的乳化剂;佐剂对照组每次每只注射 含 佐剂和 的乳化剂;空白对照组每次每只注射 的。组均腹腔注射,每隔 周免疫 次,共免疫 次。小鼠免疫之前(阴性血清)以及每次免疫之后 周采血,分离并收集血清
8、,备用。重组蛋白的 分析将 重组蛋白 进行,后转移至硝酸纤维素膜上,加入 的 脱脂奶粉,封闭过夜。随后分别与感染大片吸虫羊的血清()、未感染的阴性血清()共孵育,室温静置 ,洗涤 次,与兔抗羊 ()室温孵育 ,洗涤 次,用自动化学发光图像分析系统进行成像分析。检测特异性 抗体水平以纯化的重组蛋白 为抗原包被 板,以 中制备的免疫血清为一抗,检测 组小鼠免疫前后血清中抗 特异性抗体 的效价变化。以包被缓冲液稀释抗原浓度至 ,每孔,过夜。用 洗涤 次后,每孔加入 牛血清白蛋白进行封闭,孵 育 。洗涤 次,每孔加入 被检血清(),孵育 。洗涤 次,加入羊抗小鼠 ()孵育 。洗涤 次,然后加入可溶性
9、底物 ,避光显色,加入 (孔)终止反应,用 公司的酶标仪测定 处的吸光值。重组蛋白的酶活性分析采用 磷酸甘油脱氢酶偶联法对该重组蛋白进行酶活性研究,偶联反应式如下:型甘油醛磷酸二羟丙酮磷酸;二羟丙酮磷酸 磷酸甘油。反应的溶液为 缓冲液(三乙醇胺,)添加 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(),个单位的 磷酸甘油脱氢酶()和 型甘油醛磷酸()。加入 的 开始反应。以质粒()作为阴性对照。值对酶活性的影响调节反应体系 值依次为 、。分别测定上述反应体系在各个 条件下 内 处吸光度的变化情况。温度对酶活性的影响选用、和 共 个温度点,分别测定上述反应体系在各温度条件下 内 处吸光度的变化情况。动力学参数测定反应混
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