SC∕T 7237-2020 虾虹彩病毒病诊断规程(水产).pdf
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1、ICS 65.020.30 B 41 :才叫中华人民共和国水产行业标准SC/T 7237一2020虾虹彩病毒病诊断规程Code of diagnosis for infection with Decapod iridescent virus 1 2020-08-26发布2021-01-01实施/巳气中华人民共和国农业农村部发布本标准由全国水产标准化技术委员会(SAC/TC156)归口。本标准起草单位:中国水产科学研究院黄海水产研究所。本标准主要起草人邱亮、梁艳、黄债、陈蒙蒙、杨冰、万晓援、张庆利。SC/T 7237-2020 I SC/T 7237- 2020 虾虹彩病毒病诊断规程范围本标准给
2、出了虾虹彩病毒病(infectionwith Decapod iridescent virus 1)诊断所需试剂和材料、器材和1设备、临床症状,规定了采样、组织病理学检测、套式PCR检测和综合判定的要求。本标准适用工阳忻扭叫2 规范性引用文件下列1千元凡是不注日期的引GB/T 28630 3 缩赂语下列bp: DIV1 : DNA: dNTPs: EDTA PCR: SOS: Taq酶Tris: TE:Tris 4 试剂和材料4. 1 除非另有说明,4. 2 二甲苯:分析纯。4. 3 石蜡(熔点520C544. 4 中性树胶。4. 5戴维森氏AFA(Oavidsons4. 6苏木精染色液见A.
3、204.7 1%伊红储存液,见A.30 4.8 1%焰红储存液见A.404. 9 伊红-焰红染色液:见A.50 4 10 粘片剂:见A.6。4 11 元水乙醇分析纯。4 12 95%乙醇分析纯。4 13 85%乙蹲.见A.70 4. 14 80%乙醇:见A.8。SC/T 7237-2020 4.15 75%乙薛见A.90 4. 16 50%乙醇见A.100 4. 17 组织病理学检测阳性对照为感染DIV1且有明显病理变化的对虾头胸部组织切片。4 18 组织病理学检测阴性对照为未感染DIV1的正常对虾头胸部组织切片。4.19 TE缓冲液见A.ll。4.20 抽提缓冲液:见A.1204.21 蛋白
4、酶K见A.1304. 22 10 mol/L乙酸钱见A.140 4.23 Tris饱和盼(pH7.8),分析纯。4.24 盼/氯仿/异戊蹲(25 24 1)分析纯。4.25 氯仿/异戊蹲(24 1)分析纯。4.26 dNTPs(各2.5 mmol/U ,含dATP、dTTP、dGTP、dCTP各2.5mmol/L的混合物,一200C保存。4.27 10XPCR缓冲液,无Mg2+,随T叫酶提供,一200C保存。4. 28 MgCl, (25 mmol/U,一200C保存。4.29 T,q酶(5U/U, -200C保存。4. 30 套式PCR使用2对引物,引物浓度为10mol/L。其中,外侧引物F
5、1和Rl,扩增457bp片段;内侧引物F2和R2,扩增129bp片段。引物序列如下引物F1,5-GGG-CGG-GAG-ATG-GTG-TTA-GAT-3; 引物R1,5-TCG-TTT-CGG-TAC-GAA-GAT-GTA-3; 引物F2,5-CGG-GAA-ACG-ATT-CGT-ATT-GGG-3; 引物R2,5-TTG-CTT-GAT-CGG-CAT-CCT-TGA-3 0 4.31 以十足目生物DNA中的848bp片段为内参。引物浓度为10mol/L,序列如下.引物F3,5-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-T寸G-TAG-3; 引物R3,5仁TTC-AGN-TTT-
6、GCA-ACC-ATA-CTT-CCC扩。注N表示G、A、T或C。4.32套式PCR检测阳性对照为已知感染DIV1且套式PCR结果显示阳性的对虾组织样品,-800C 保存。4.33 套式PCR检测阴性对照为已知未感染DIV1的对虾组织样品,-800C保存。434 套式PCR检测空白对照为水。4.35 50X电泳缓冲液:见A.15。4.36 1X电泳缓冲液:见A.16。4. 37 琼脂糖:生化试剂。4.38 DNA分子量标准:生化试lfiL4.39 6X载样缓冲液生化试剂。4. 40 电泳核酸染料.生化和J剂。5 器材和设备5. 1 切片机。5.2 组织脱水机。5 3 包埋机。54 染色机。5.
7、5 展片机。2 SC/T 7237-2020 5 6 平板烘片机。5. 7 光学显微镜。5. 8 恒温箱5.9 PCR1义。5 10 电泳仪。5. 11 水平电泳梢。5.12 紫外观察仪或凝胶成像仪。5.13 高速冷冻离心机。5.14 水浴锅或金属浴。5 15 普通冰箱。5. 16 -80.C超低温冰箱。5.17 电炉或微波炉。5.18 微量移液器。6 I恼床症状濒死的虾失去游动能力,沉入池底。发病个体的肝膜腺萎缩、颜色变浅,空肠空胃。患病罗氏沼虾的额剑基部组织呈典型的白色病变。部分患病凡纳滨对虾出现红体症状。随着病程的发展,表现出高死亡率。参见附录B。7 采样7.1 采样对象凡纳滨对虾(Li
8、to户enaeusvanamei)、罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)和克氏原整虾(Procambrus clarkii)等易感宿主。参见附录B中的B.3. 7. 2 采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630. 4-2012中附录B的要求。7.3 样品的采集7.3.1 组织病理学检测时,采集造血组织、怨和肝腕腺。7.3.2 套式PCR检测时,仔虾采集除II球和H柄外的完整个体;幼虾至成虾阶段采集头胸部(虫草、肝JFn腺、造血组织)、附肢或血淋巴。亲虾的非致死检测采集血淋巴、附肢或粪便。仔虾可以合并样本检测,个体稍大的虾可按个体进行检测。所取样品分别置于1.5
9、mL离心笛中,立即进行DNA提取操作或暂时保存于一20.C。B 组织病理学检测8. 1 样品准备样品固定方法和切片前的取材修整,应符合GB/T28630. 4-2012中附录B的要求。8 2 脱水75%乙蹲(1h 45 min)85%乙醇(lh 45 min)85%乙醇(1h 45 min)95%乙醇(45min)95% 乙醇(45min)无水乙碎(45min)无水乙醇(45min)。8. 3 透明无水乙酶二甲苯(l, 1) (25 min)二甲苯(20min)二甲苯(20min)。8.4 浸蜡纯石蜡(lh 20 min)纯石蜡(1h 20 min)。8.5 包埋3 SC/T 7237-202
10、0 用包埋机进行包埋.8 6 切片用切片机切片,厚度5m。对每个石蜡包埋块至少切取2块不连续的切片。8 7 展片展片机(40C)中展片,用涂有一层粘片剂的载玻片捞出,置于平板烘片机45C烘片2h. 8. 8 染色二甲苯(5min)二甲苯(5rnin)元水乙蹲(2min)无水乙醇(2rnin)95%乙醇(2min)95%乙醇(2 min)80%乙醇(2rnin)80%乙蹲(27./(2 min)苏木精染色液(5(1 min 20 s)95%乙蹲(2(2 min 30 s)二甲苯(28. 9 封片8. 10 9 9. 1 DNA 9. 11取f坚阳性对照、9.12 9.13 两相。9.1.4 10
11、 000 r/min离心9.15 水相移至离心1min分离两相。9.16 水相移至一新L水乙蹲(-20C)混匀,-20C9.17 用70%乙蹲洗涤沉淀2次,晾干。9. 1. 8 加入100L灭菌双蒸水溶解DNA,待用.min)蒸馆水(2rnin)蒸f留水(2min)蒸馆红染色液(2min)95%乙醇同时设5 min,弃上清液。DNA沉淀于室温9.19 若DNA样品需要保存,可溶解于100LTE缓冲液中并保存于20C。9.110 可以采用同等拍提效果的其他方法或使用商品化DNA抽提试剂盒。9. 2 套式PCR扩增9. 2 1 套式PCR反应体系按照表l的要求,加入除Taq酶以外的各项试剂,推荐配
12、制成大体积的预温液,分装保存于20C . I陆用前,加入相应体积的Taq酶,混匀,按24L/反应分装到O.2 mL PCR管中.加入样品的模板DNA(浓度250ng/L)1L,同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。4 SC/ T 7237- 2020 表1套式PCR扩增的第一步PCR反应预混液所需试剂组成试剂25L体系试剂终浓度10XPCR缓冲液(元Mg+)2.5L 1X PCR缓冲液MgCI, (25 mmol/Ll 2L 2 mmol/L dNTPs(各2.5mmol/L) 2L 200mol/L 外侧引物F100mol/UlL 0.4mol/L 外但l引物R1(lOmol/L)1L O .
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