SC∕T 7206.3-2007 牡蛎单孢子虫病诊断规程 第3部分:原位杂交诊断法(水产).pdf
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1、ICS 65.020.30 B 41 中华人民共和国水产行业标准SC/T 7206.3-2007 牡航单抱子虫病诊断规程第3部分:原位杂交诊断法Dia伊osticProcoIs for Haplosporidiosis of Oyster一Part 3: in situ Hybridization Metbod 2007-06-14发布2007-09-01实施中华人民共和国农业部发布前E SC/ T 72师牡筋单泡子虫病诊断规程分为三个部分.一一第1部分:组织印片的细胞学诊断法;一一第2部分:组织病理学诊断法;一第3部分:原位杂交诊断法。本部分为SC/T7206的第3部分。本部分的附录A为规范
2、性附录。本部分由中华人民共和国农业部提出。本部分由全国水产标准化技术委员会归口。SC/ T 7206.3-2007 本部分起草单位.中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站、深圳出入境检验检疫局。本部分主要起草人:杨冰、黄健、陈爱平、江育林、王崇明、王秀华、魏琦、刘莉。I SC/ T 7206.3-2007 1 范围牡蜻单袍子虫病诊断规程第3部分:原位杂交诊断法SC/T 7206的本部分规定了牡贩尼氏单泡子虫病的原位杂交诊断方法的原理、试剂与材料、仪器设备、操作步骤和结果判定。本部分根据尼氏单袍子虫在组织中的定位与感染程度对牡妨单袍子虫病进行确诊。2 规范性引用文件下列文件中的条
3、款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。SC/ T 7202.3-27斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分组织病理学诊断法SC/T 7205.1-27牡纺包纳米虫病诊断规程第1部分.组织印片的细胞学珍断法SC/ T 7206.1-2007牡甥单泡子虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法3 原理3. 1 牡航尼氏单袍子虫及其病理学特征见SC/T7206.1-27 (牡妨单抱子虫病诊断规程第1部分
4、组织印片的细胞学诊断法)中3.1的规定。3.2 技术原理原位杂交检测方法是以非放射性标记物一-地高辛(DIG)标记的WSSV核酸探针与存在于切片中的WSSVDNA进行核酸分子杂交,并通过抗原一抗体反应和酶-底物的化学显色反应在组织切片上显示出WSSV的存在位点。原位杂交可完整地保持组织与细胞的形态,能在复杂的组织中针对单一细胞进行病毒检测,准确地反映出组织细胞中病毒的分布。4 试剂和材料4. 1 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馆水或去离子水或相当纯度的水。4.2寡聚核背酸探针MSX1347:序列为:5-ATEKTGT-TGOTGA-CGC-TAA-c3,合成时用地高辛(DI
5、G)标记的脱氧核糖核昔尿略咬残基(D1G-dU)代替脱氧核糖核背胸腺嘀咬残基(dT)。4.3碱位磷酸酶偶联的DIG抗体(AP-抗DIG,O.75UIL,4t:) :生化试剂。4.4 二甲苯。4.5元水乙醇。I 4.6川乙醇。4.7 中性树胶:生物染色用。4 8 石蜡(熔点52t:-54(;)切片级4.9 戴维森氏AFA(Davidsons AFA)固定液按SCIT 7202. 3-2007 (斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分:组织病理学诊断法)附录A的规定。l SC/ T 7206.3-2007 4.10 80%乙醉按SC/T7202. 3-2007 (斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分:组
6、织病理学诊断法)附录A的规定。4.11 70%乙醇按SC/T7202. 3-2007 (斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分:组织病理学诊断法)附录A的规定。4.12 50%乙醇按SC/T7202.3-27 (斑节对虾杆状病毒病诊断规程第3部分.组织病理学诊断法)附录A的规定。4.13 500周ImL多聚赖氨酸按附录A的规定。4.14 2XSSC按附录A的规定。4.15 lX汇按附录A的规定。4.16 0.5x挺直二按附录A的规定。4.17 TNE按附录A的规定。4.18 100g/mL蛋白酶K按附录A的规定。4.19 0.4%甲醒按附录A的规定。4.20 杂交缓冲液按附录A的规定。4.21 缓
7、冲液I按附录A规定。4.22 缓冲液E按附录A规定。4.23缓冲液阻按附录A规定。4.24 缓冲液N按附录A规定。4.25 显影液按附录A规定。4.26 0.5%停斯麦棕Y(Bismarkbrown Y)按附录A规定。427 阳性对照为受尼氏单袍子虫感染且组织病理学上有明显病灶的牡妨组织切片(未脱蜡)。4.28 阴性对照为未受尼氏单抱子虫感染且经原位杂交证明为阴性的牡蜘组织切片(未脱蜡)。5 器材和说备5. 1 石蜡切片机:满足4阳-7m厚度的石蜡连续切片要求。5.2 水浴锅室温-100t:,士lt:。5.3 显微镜:带高倍镜(40 x)和汹镜(100 x )。5.4 微量移液器:量程。.5L
8、-I0L,5L-40L、40L-200L、2L-l仅用L各1支。5.5 普通冰箱:具冷藏箱,并带-18t:以下冷冻箱体。5.6 程控组织脱水机或使用手工脱水步骤。5.7 石蜡包埋机或使用手工包埋步骤。5.8 程控切片染色机或使用手工染色步骤。5.9 切片保湿孵育箱:室温-50t:,+1t:或使用自制的简易湿盒放置于恒温箱中。5.10 展片水浴锅:敝口,无盖水浴锅或使用自1M保温盒内加一定温度的水代替。5. 11 平板烘片机:室温-loot:或使用恒温箱代替。5.12 切片染色杯。5.13 医用慑子。5. 14 毛笔。5. 15玻片架。5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 吸管。载玻
9、片。盖玻片。吸水纸。暗盒:可用任何能避免强光直射的盒子。6 操作步6. 1 组织切片制备6. 1. 1 样品的采集按SC/T7205. 1-2007 (牡蜘包纳米虫病诊断规程诊断法)附录B执行。SC/ T 7206.3-2007 第1部分组织印片的细胞学6.1.2 取活体牡勤,沿着牡捕的纵向剖面切取内脏团组织块,置于David田nsAFA固定液中固定24h (固定液的体积应超出样品体积10倍以上),随后换为70%乙醇保存。组织切片前先要取材切块,将固定样品根据其病灶定位,切削成约3mm-5mm的小块,厚度不超过5rnmo 6. 1 .3按SC/T7202.3-2007(斑节对虾杆状病毒病诊断规
10、程第3部分.组织病理学诊断法)中6.2-6.5的规定将样品置于程控组织脱水机中依次进行脱水、透明、浸蜡,完毕后取出在石蜡包埋机上进行包埋。用石蜡切片机进行切片,切片厚度6m,用毛笔将切片移入展片水浴锅内展片,用已被500g/mL多聚赖氨酸预先包被的载玻片将切片捞起,置于温箱中40t:温干过夜。6.2 原位杂交6.2.1 组织切片(包括阴性对照和阳性对照)在程控切片染色机中依次通过二甲苯(2次,10minl/i:)、无水乙醇(2次,10min/次)、95%乙醇(2次,10 sl次)、80%乙醇(2次,10sl次)、50%乙醇(1次,10纱,然后用PBS冲洗6次(勿让切片干燥)。6.2.2 组织切
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