不同居群北柴胡ISSR遗传多样性分析.pdf
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1、生物技术进展生物技术进展 2023 年 第 13 卷 第 6 期 919 924Current Biotechnology ISSN 20952341研究论文研究论文Articles不同居群北柴胡ISSR遗传多样性分析闫晓睿,薛帼珍,杨晓霞,王宇,杜晨晖,张朔生,刘计权*山西中医药大学中药与食品工程学院,山西 晋中 030619摘要:利用简单重复间序列(inter-simple sequence repeat,ISSR)分子标记技术对10个不同居群的北柴胡样品进行遗传多样性分析,为进一步开展北柴胡优良种质的选育提供依据。以不同居群的北柴胡新鲜叶片为材料,用植物组织DNA提取试剂盒提取北柴胡样品
2、DNA。利用单因素梯度实验研究最佳ISSR-PCR反应体系,将不同居群的DNA扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,利用NTSYS-pc软件分析不同居群北柴胡的遗传多样性。结果发现,10个居群的北柴胡遗传相似系数介于0.142 81.000 0。经聚类分析,10个不同居群的北柴胡分为3大类,第1类为甘肃北柴胡;第2类包括5个北柴胡样品,分别为陵川、河南、闻喜、平陆、襄汾北柴胡,均属于山西省晋南居群;第3类包括4个北柴胡样品,分别为内蒙古、临汾、浑源、广灵北柴胡,类属于山西省北部居群及内蒙古居群;10个居群的北柴胡存在比较丰富的遗传多样性,且与其地理环境有一定的关联性。研究结果可为北柴胡种质资源保护及优良
3、种质选育提供理论依据。关键词:北柴胡;ISSR;PCR扩增;聚类分析;遗传多样性DOI:10.19586/j.20952341.2023.0084 中图分类号:Q37,R932 文献标志码:AISSR Genetic Diversity Analysis of Bupleurum chinense from Different PopulationsYAN Xiaorui,XUE Guozhen,YANG Xiaoxia,WANG Yu,DU Chenhui,ZHANG Shuosheng,LIU Jiquan*College of Chinese Medicine and Food Engi
4、neering,Shanxi University of Chinese Medicine,Shanxi Jinzhong 030619,ChinaAbstract:The genetic diversity of 10 different populations of Bupleurum chinense was studied by inter-simple sequence repeat(ISSR)molecular marker technique,in order to provide basis for further breeding of B.chinense.The DNA
5、of Bupleurum chinense samples from fresh leaves of different populations was extracted by the plant tissue DNA extraction kit.The single factor gradient experiment was used to study the optimal ISSR-PCR reaction system.The DNA amplification products of different populations were subjected to agarose
6、 gel electrophoresis,and the genetic diversity of different populations of B.chinense was analyzed by NTSYS-pc software.The results showed that the genetic similarity coefficient of 10 populations ranged from 0.142 8 to 1.000 0.10 different populations were divided into three categories by cluster a
7、nalysis,with the first category being Gansu.The second category included five samples of B.chinense,Lingchuan,Henan,Wenxi,Pinglu,and Xiangfen,all belonging to the Jinnan population in Shanxi Province.The third category included four samples,namely Inner Mongolia,Linfen,Hunyuan,and Guangling,belongin
8、g to the northern population of Shanxi Province and Inner Mongolia.The 10 populations of B.chinense have relatively abundant genetic diversity and are related to their geographical environment.The results could provide theoretical basis for germplasm resources protection and elite germplasm breeding
9、 of B.chinense.Key words:Bupleurum chinense;ISSR;PCR amplification;cluster analysis;genetic diversity收稿日期:20230615;接受日期:20231016基金项目:山西省自然基金面上项目(20210302123233;20230602324694);山西道地药材品质形成机制创新团队项目(2022TD2009);山西中医药大学中药资源学科建设项目(2023XKJS-24);山西中药材产业技术体系项目(CZ2023018);山西中医药大学太行本草专项(2022PY-TH-30)。联系方式:闫晓睿
10、E-mail:;*通信作者 刘计权 E-mail:生物技术进展生物技术进展 Current Biotechnology中药柴胡最早出现于 神农本草经,被列为“上品”,到目前为止已经使用了两千多年 1。柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根,按性状不同,分别习称“北柴胡”和“南柴胡”2。柴胡具有解表和里、疏肝解郁、升提中气之功效,主治感冒发热、寒热往来、黄疸肝炎及月经不调等 3。其中,北柴胡主要产自山西、河北、河南、辽宁等省份,而南柴胡主要产于湖北、四川、安徽等省份。根据相关资料显示,全
11、世界柴胡属植物大约有200种,我国现已明确的柴胡属植物共有42个种、17个变种和7个变型 4-6。除海南省外,柴胡在我国其他省份都有分布 7。柴胡种源丰富,在一定程度上给鉴别工作带来了不小难度。自古以来,山西省都是道地药材柴胡的重要产地之一,省内南北地理较大的跨度导致柴胡在不同的地理位置、气候、水土等条件影响下的内在质量和外观性状良莠不齐。因此,对不同来源柴胡的遗传多样性及其亲缘关系进行分析具有重要意义。现阶段对柴胡真伪鉴别的方法有随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、简单重复序列(simple sequence repeat,SS
12、R)、内源转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)片段及ISSR分子标记等8。本研究采取液氮研磨提取法,提取了 10 个不同居群的北柴胡 DNA,对其ISSR-PCR反应体系进行优化,并研究了10个居群的北柴胡样品的种内亲缘关系,以期为胡柴的良种选育、规范化栽培和临床应用提供一定参考。1材料与方法1.1仪器与试药AB135-S型电子分析天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;HH-4数显恒温水浴锅购自金坛市杰瑞尔电器有限公司;H2016D高速离心机购自上海知信实验仪器有限公司;MX-S涡旋振荡器购自大龙兴创实验仪器(北京)有限公司;EasyCycler
13、96PCR扩增仪购自德国耶拿分析仪器股份公司;DYY-6C型稳压稳流电泳仪购自北京市六一生物科技有限公司;NanoDrop 2000超微量分光光度计购自美国 Thermo公司;ZF-258全自动凝胶成像分析系统购自上海嘉鹏科技有限公司;TWD-9403C紫外仪购自北京六一生物科技有限公司。DP3112植物组织DNA提取试剂盒购自无锡百泰克生物技术有限公司;Premix Taq DNA酶购自宝日医生物技术有限公司;引物由美国Thermo公司合成;DL2000 DNA Marker、琼脂糖、5TBE缓冲液、无酶无菌水、TE缓冲液均购自北京索莱宝科技有限公司。1.2实验材料实验用北柴胡供试品来源于甘
14、肃、山西、河南、内蒙古等10个产地(表1)。于2021年4月15日5月1日进行取样,分别取各居群新鲜、健康的柴胡植株叶片叶尖。将采集样品带回实验室-25 保存备用。所有实验材料经山西中医药大学刘计权教授鉴别,均属于伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.。1.3北柴胡DNA的提取取新鲜北柴胡叶片叶尖适量,加入液氮充分研磨至细粉状。参照植物组织DNA提取试剂盒说明书提取样品DNA,采用精密紫外分光光度计测表1不同产地北柴胡环境因子原始数据Table 1Raw data of environmental factors of B.chinense from different p
15、roducing areas产地甘肃省庆阳市董志镇董志村山西省陵川县潞城镇潞城村山西省闻喜县后宫乡古塬庄村山西省平陆县张店镇候王村河南省嵩县车村镇河北村内蒙古清水河县城关镇城关村山西省临汾贺家庄乡贺家庄村山西省浑源千佛岭乡宽坪村山西省广灵县南村镇鳌裕村山西省襄汾县南辛店乡中陈村东经107.27113.25111.54111.17112.12111.82111.64113.74114.14111.43北纬35.2535.6535.3434.9933.7940.3835.9839.4539.7435.92海拔/m1 421.001 104.001 072.00758.00890.001 199.0
16、0799.001 910.001 325.00414.00年均温/10.009.8012.5013.8014.806.5012.106.207.0011.50年平均降雨量/mm547.00703.00439.80673.00600.00398.20514.80424.60388.00550.00年平均日照/h2 465.302 663.002 461.002 226.002 296.002 913.002 466.702 696.001 500.002 228.00无霜期/d175.00183.00190.00230.00187.00128.00190.00130.00134.00185.00
17、920闫晓睿,等:不同居群北柴胡ISSR遗传多样性分析定OD260/OD280及 DNA 浓度,剩余的 DNA 样品于-20 低温保存备用。1.4反应体系的优化1.4.1Premix Taq-DNA 酶的最佳加入量结合文献9-10及预实验结果综合分析,反应程序为:94 预变性5 min;94 变性1 min,52 退火45 s,72 延伸 2 min,共 45 个循环;最后 72 延伸7 min。本实验使用引物808,PCR扩增采取25 L反应体系,包括模板DNA 20 ng、10 mol L-1引物2 L,Premix Taq DNA酶设置了10.0、12.5、15.0 L 3个体积,无酶无
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