NY∕T 3278.3-2018 微生物农药 环境增值试验准则 第3部分:植物叶面(农业).pdf
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1、ICS 65.020 B17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/ T 3278.3一2018微生物农药环境增殖试验准则第3部分:植物叶面Environmental reproduction test guidelines for microbial pesticides-Part 3 Foliar surface 2018-07 -27发布2018-12-01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3278.3-2018 前言NY/ T 3278 (微生物农药环境增殖试验准则),分为3个部分:一一第1部分:土壤;一一第2部分:水;一一第3部分:植物叶面。本部分为NY/T3278的第3部分
2、。本部分按照GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位:农业农村部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:谭丽超、周艳明、卡元卿、廖建华、袁善奎、姜辉、蒋金花、吕露。I 范围微生物农药环境增殖试验准则第3部分:植物叶面本部分规定了微生物农药植物叶面报告等的基本要求。本部分适用于农药登记而2 规范性引用文件下列文件对于本件。凡是不注日期的GB 15618 3 术语和定义下列术语3. 1 微生物NY/T 3278.3-2018 、数据处理、质量控
3、制、试验以细菌、真矗I帚锺铺盖革虽苟摒巍物缰鳝疆疆疆篝疆疆命咀E、虫、草、鼠等有害生3.2 供试物试验3.3 3.4 菌落形成单位由单个菌细菌芽抱bacterial 某些细菌在其生长发育眠体。3.5 真菌抱子fungal spore 真菌的主要繁殖器官。分为有性抱子和无性抱子两大类。抱子在适宜条件下发芽,形成菌丝而进行分裂繁殖;当外界环境不适宜时,可以呈休眠状态长时间生存。3.6 细菌抱囊bacterial cyst 某些细菌尤其是一些固氮菌在外界缺乏营养的条件下,由整个营养细胞外壁加厚、细胞失水而形成的一种抗干旱但不抗热的圆形休眠体。1 NY/T 3278.3-2018 3. 7 原生动物抱
4、囊protozoan cyst 某些原生动物在外界环境不利条件下,形成的能高度抵抗干旱、冰冻和高温的休眠体。3. 8 细菌营养体吨etativebacterium 单个活的生物体,通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.9 原生动物protozoa 最原始、最低等的单细胞动物。原生动物除了具有真核细胞的一般特征(具细胞膜、细胞核和细胞质等)外,其细胞本身是一独立完整的有机体,通过细胞内和细胞表面的一些特殊细胞器来完成运动、营养和生殖等生命活动。3. 10 宿存survival 具有活性的微生物在施用后的一段时间内可在动物、土壤或植物内体或表面保持活性的状态。3. 11 增殖mult
5、iplication 微生物生长到一定阶段,由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体,即引起生命个体数量增加的生物学过程。3. 12 延滞期lag phase 少量微生物接种到新鲜培养基后,在开始培养的一段时间内,因代谢系统适应新环境的需要,微生物数目没有增加的一段时期。3. 13 指数期log phase 在生长曲线中,紧接着延滞期的一段微生物数量以几何级增长的时期。3. 14 稳定期stationary ph描e新增殖的微生物数量与衰亡的微生物数量相等的时期,这个时期的菌体数量达到最高。3. 15 衰亡期death ph描e微生物的个体死亡速度超过新增殖速度,整个群体呈现负生
6、长状态的时期。4 试验概述将供试物喷施于植物叶面上,在适宜的条件下培养,定时取样测定其数量,得到供试物在植物叶面上的动态变化。5 试验方法5. 1 材料和条件5. 1. 1 试验用植物推荐棉花作为试验用植物,也可以选择生物农药登记作物或其他具有重要经济、生态价值的植物。植物种子表面消毒后播种于人工基质或自然土壤,自然土壤符合GB15618二级标准的要求,放置在温度、湿度、光照等条件适宜的温室或人工气候箱中,适时挠灌无菌水,待种子发芽生长至苗期(30d 40 d)时,选择健康植株待用。5. 1.2 供试物5. 1.2. 1 类型供试物包括微生物农药母药、制剂产品。5. 1.2.2 批次试验中供试
7、物应采用同一批次的产品。5. 1.3 主要仪器设备超净工作台。磁力搅拌器。灭菌锅。显微镜。分光光度计。荧光定量PCR仪。温度计。电子天平。5. 2 试验操作8株105. 2. 2 接种量接种浓度为菌株接种浓度。在超净工作台气候箱中,适光照等培养参数。上5. 2. 4 取样旋振荡器振荡10min) ,进行计数。的具体生长情况调整。5. 2. 5 计数方法5.2.5. 1 细菌、放线菌、真菌、酵母NY/T 3278.3-2018 ,元菌水振荡分离(涡间隔时间可根据供试物以CFU为计数单位,可采用绿色荧光蛋白基因标记-平板计数法(参见附录A)测定。以基因拷贝数为计数单位,可采用分子标记-荧光定量PC
8、R法(参见附录B)测定。5.2.5.2 原生动物、真菌抱子、酵母以个体数目为计数单位,可采用直接计数法(参见附录。等测定。5. 2. 6 试验周期试验持续时间应能够反映供试物的延滞期、指数期、稳定期和衰亡期,或在28d内检测到供试物数NY/T 3278.3-2018 量维持稳定或低于初始接种量,则可结束试验。5. 2. 7 生长-消亡曲线以培养时间为横坐标、以供试物含量的对数为纵坐标做图,绘出供试物的生长-消亡曲线。5. 3 数据处理5.3. 1 独立样本t检验2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。式中:X1,X2一一分别为两样本平均数;41,吃一一分别为两样本方差
9、; 样本容量。5.3.2 单因子方差分析(One-Way ANOVA) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。单因子方差分析LSD检验按式(2)计算。. (1) LSDa = ta(df,) 5王-E.(2) 式中:ta(df.)一一在F检验中误差自由度下,显著水平为的临界t值;S王一一均数差异标准误,按式(3)计算。式中:MS.一-F检验中误差均方;m 一一各处理重复数。S可=/2丽./m. . (3) 5. 4 质量控制使用荧光定量PCR法计数微生物数量时,扩增效率的范围应为90%110%。6 试验报告试验报告应包括下列内容,但不限于以下内容:a) 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号
10、;b) 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况;c) 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期;d) 供试物基本信息(如含量和组成信息,以及任何改变供试物生物活性物质的含量和组成信息、施用量、施用方法等); e) 试验系统的详细描述;f) 试验条件,包括试验温度、湿度、光照等;g) 试验结果,绘制供试物的生长-消亡曲线。4 NY/T 3278.3-2018 附录A(资料性附录)绿色荧光蛋白基因标记-平板计数法A. 1 方法原理将含有绿色荧光蛋白基因的质粒通过生物化学方法导人到供试物体内,转化后的供试物能够在紫外透射下发出绿色荧光,而环境中其他微生物则不发绿色荧光
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