补肾壮骨方通过EphB4_Ephrin-B2轴缓解绝经后骨质疏松.pdf
《补肾壮骨方通过EphB4_Ephrin-B2轴缓解绝经后骨质疏松.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《补肾壮骨方通过EphB4_Ephrin-B2轴缓解绝经后骨质疏松.pdf(5页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、68JIANGXI JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE中药研究补肾壮骨方通过 EphB4/Ephrin-B2 轴缓解绝经后骨质疏松吴志明1 袁振兴2 勒春1 曹正柳3 万欣1 周易芬1 张鹏1(1.南昌大学第一附属医院中医科 南昌330000;2.九江市第六人民医院中医科 江西九江332000;3.南昌大学第二附属医院中医科 南昌330000)摘要目的:探讨补肾壮骨方是否通过 EphB4/Ephrin-B2 轴缓解绝经后骨质疏松。方法:采用临床疗效确切的补肾壮骨方灌服绝经后骨质疏松小鼠模型,取 BALB/c 小鼠 50 只,随机分为正常对照组、假手术
2、对照组、去势手术组、补肾壮骨方组、雌激素组。正常对照组、假手术对照组与去势手术组灌服生理盐水,补肾壮骨方组、雌激素组分别灌服等体积补肾壮骨方、雌激素,灌胃 12 周后处死小鼠,取血和骨进行检测。ELISA 检测 E2、FSH、LH 性激素水平及骨生化指标;Westernblot 检测 EphB4、Ephrin-B2 蛋白表达水平;Micro-CT 成像检测骨密度和骨小梁参数。结果:去势手术组小鼠体重高于其他 4 组(P0.05);在性激素方面,去势手术组 FSH、LH 水平明显高于其他 4 组,E2水平低于其他 4 组(P0.05)。在骨生化指标方面,去势手术组 ALP 明显高于其他 4 组,
3、Ca、P 含量明显低于其他 4 组(P0.05)。在骨密度及骨结构参数方面,去势手术组 BMD、BV/TV、Tb.Th 显著低于其他 4 组(P0.05),补肾壮骨方组与雌激素组中 BMD、BV/TV 低于正常对照组与假手术组(P0.05)。Westernblot 检测提示去势手术组 EphB4 蛋白表达的显著低于其他 4 组(P0.05),补肾壮骨方组与雌激素组低于正常对照组与假手术对照组(P0.05);Ephrin-B2 蛋白表达在去势手术组显著高于其他 4 组(P0.05),补肾壮骨方组与雌激素组高于正常对照组与假手术对照组(P0.05)。结论:补肾壮骨方通过调节 EphB4/Ephri
4、n-B2 信号轴缓解绝经后骨质疏松,为临床应用补肾壮骨方提供可靠证据。关键词补肾壮骨方;绝经后骨质疏松症;EphB4;Ephrin-B2;性激素中图分类号:R285 文献标志码:A绝经后骨质疏松症(postmenopausalosteoporosis,PMO)主要表现为绝经后老年女性骨量减少,骨结构变化引起髋关节及椎体压缩性骨折等1-2。PMO使老年人骨折风险、致残风险及死亡率显著升高,增加公共卫生负担3。雌激素替代疗法是预防和治疗 PMO 进展和降低骨折风险的现代医学经典的治疗方法4。然而,雌激素替代疗法可能导致乳腺癌、妇科肿瘤及冠心病等心血管疾病的发生5。因此,急需寻找疗效较佳、副作用较小
5、的天然替代品预防和治疗骨质疏松引起的骨质流失和骨折风险。补肾壮骨方组成为生地黄 15g,知母 15g,补骨脂 12g,巴戟天 12g,淫羊藿 15g,枸杞子 12g,酸枣仁 10g,黄柏 10g,具有补肾宁心,燮理阴阳的功能。其不仅能有效地改善围绝经期妇女的神经症状,同时对绝经后骨质疏松有良好的防治作用。预试验结果发现围绝经期妇女在口服补肾壮骨方后,外周血雌激素(estrogen2,E2)水平无明显变化,Th 细胞比例显著增加。本实验通过 ELISA 分析补肾壮骨方对绝经后骨质疏松小鼠模型性激素水平及骨生化指标的影响,Westernblot 分析补肾壮骨方对成骨细胞和破骨细胞 EphB4、Ep
6、hrin-B2 蛋白表达的影响,Micro-CT 成像检测体内骨密度及骨小梁参数,进一步阐明该复方防治绝经后骨质疏松的疗效与作用机制。1 材料与方法1.1 实验药物与试剂补肾壮骨方:江西省国医名师曹正柳创立,包含生地黄 15g,知母 15g,补骨脂 12g,巴戟天 12g,淫羊藿 15g,枸杞子 12g,酸枣仁 10g,黄柏 10g。此方剂中所有中药饮片均由南昌大学第一附属医院中药房提供,按照每 100g 中药饮片配比 800mL 饮用水,按常规煎煮方法进行制备。其后,进行过滤浓缩至生药 2.5g/mL,成品储存于 4恒温冰箱之中。雌激素组采用戊酸雌二醇片(补佳乐,拜耳医药上海有限公司,批号
7、J20171038),成人日用量 1mg,换算成小鼠为基金项目:江西省中医药科技计划项目(2020B0341)。第一作者:吴志明,博士,副主任中医师。E-mail:。69江西中医药 2023 年 11 月第 11 期总第 54 卷第 491 期中药研究每天 0.13mg/kg,小鼠每天灌胃容量为 0.10mL/10g,雌二醇溶液含药量为 0.013mg/mL,配制好后置于 4 冰箱中贮存备用。E2、FSH、LH 性激素ELISA 试剂盒(上海江莱生物科技有限公司,货号1530503688、1533849327、1533697166);Ca、P、ALP 骨生化指标试剂盒(上海江莱生物科技有限公
8、司,货 号 1529396445、1535598798、TE0009);EphB4 抗 体、Ephrin-B2 抗 体、GAPDH 抗 体(英国 Abcam 公司,货号 xy50582-R039、Hz-10659R、ab9484)。1.2 主要仪器170/3940 型转膜仪(英国伯乐公司);PVDF膜(美国 Millipore 公司);超净工作台(苏州集团安泰空气技术有限公司);万分之一分析天平(上海精科仪器有限公司);自动平衡离心机(湘仪离心机仪器有限公司);超低温冰箱(德国贺利氏公司);微量移液器(德国 Gilson 公司);Micro-CT系统(德国 SiemensAG 公司);双能 X
9、 骨密度仪(美国Hologic 公司)。1.3 动物清洁级雌性BALB/c 小鼠 50 只,1213 月龄,体重(21.511.20)g,购自南昌大学第一附属医院实验动物中心,合格证号:SYXK(赣)2021-0003。实验期间,小鼠给予常规喂养,自由进食、饮水,动物房内环境稳定室温保持在 2226,相对湿度保持在 40%60%,保持良好的通风。本研究涉及的动物实验经过南昌大学第一附属医院伦理委员会批准,伦理编号:(2021)医研伦审第(9-006)号。1.4 分组及模型建立实验小鼠根据随机数字表法分为 5 组,分别为正常对照组、假手术对照组、去势手术组、补肾壮骨方组、雌激素组。去势手术组给予
10、雌性 BALB/c小鼠氯胺酮 100mg/kg 麻醉,之后经背部入腹切除双侧卵巢;假手术组在卵巢附近切除与卵巢质量大致相等的脂肪组织,不对卵巢做任何处理;灌药6 周后,从正常对照组、假手术对照组及去势手术组随机取 2 只置于双能 X 线吸收测量仪平台上测定股骨骨密度(BMD),根据BMD含量判断是否造模成功。1.5 给药方法及剂量正常对照组:正常喂食,按 0.10mL/10g 体重灌服生理盐水,每日 1 次,连续灌胃 12 周。假手术对照组:按 0.10mL/10g 体重灌服生理盐水,每日1 次,连续灌胃 12 周。去势手术组:去势手术造模成功后,按每天 0.10mL/10g 灌服生理盐水,每
11、日1 次,连续灌胃 12 周。补肾壮骨方组:去势手术造模成功后,按 0.10mL/10g 体重灌服补肾壮骨方,每日 1 次,连续灌胃给药 12 周。雌激素组:去势手术造模成功后,雌激素组按含药量 0.013mg/mL相应溶液 0.1mL/10g 灌胃,每日 1 次,连续灌胃给药 12 周。1.6 标本的采集与处理各组小鼠末次给药 24h 后,小鼠称重,用氯胺酮 100mg/kg 对各组小鼠进行麻醉,麻醉状态下通过摘眼球取血,所取全血置于室温下 2h,以3000r/min 离心 20min,分离血清,采用 ELISA法检测血清性激素及骨生化指标。取血结束后脱颈处死小鼠,酒精浸泡消毒后完整取出双侧
12、股骨。1.7 实验检测指标及方法1.7.1 ELISA检测血清E2、FSH、LH性激素及Ca、P、ALP 骨生化指标各组小鼠采集全血后进行提取血清,保存于-80低温冰箱备用。ELISA 实验操作依照厂家说明书,最后分别计算 E2、FSH、LH性激素及 Ca、P、ALP 骨生化指标的血清浓度。1.7.2 Westernblot 检测骨组织中 EphB4、Ephrin-B2蛋白表达分别收集各组小鼠右侧股骨组织,置于预冷的生理盐水中,剔除骨外膜,用蒸馏水清洗干净血液等杂质,之后剪碎骨组织进行称重,后将碎骨放入装有液氮的研钵中研磨成粉末状。研磨完成后放入离心管中,每 100mg 骨粉末加入300L 蛋
13、白提取试剂,轻轻混匀,冰浴 30min,每5min 用漩涡混合仪振荡 20s。最后在 12000r/min转速条件下离心 15min,所得上清液为骨组织总蛋白。蛋白变性后进行 SDS-PAGE 凝胶电泳和转膜反应,将膜放入封闭液中,用 TBST 稀释脱脂牛奶至浓度为 5%,室温下脱色及封闭 60min,加入所需 EphB4、Ephrin-B2 一抗和二抗进行免疫反应。以 GAPDH 作为参照进行实验指标检测。1.7.3 Micro-CT 检测骨密度和骨结构参数各组小鼠处死后,迅速取小鼠左侧股骨,去除附着的软组织,将骨组织固定在 4%多聚甲醛溶液中。将股骨标本置于标本杯中固定,采用体外 Micr
14、o-CT 断层扫描技术对股骨骨密度、骨结构进行扫描。扫描条件设置为电压 70kV,扫描电流 200A,层间距 14.80m,平面分辨率 300ms,连续扫描约 808 层。检测骨密度(BMD)、骨体积/总体积(BV/TV)、小梁骨数目(Tb.N)和小梁厚度(Tb.Th)。70JIANGXI JOURNAL OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE中药研究1.8 统计学方法数据使用 SPSS21.0 统计软件进行分析,实验结果用均数 标准差(xs)表示,每组间用单因素方差分析,以 P0.05 表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 各组小鼠体重的比较实验开始前及第 6 周各
15、组小鼠的体重无统计学意义,12 周后去势手术组、雌激素组小鼠体重均高于正常对照组、假手术对照组及补肾壮骨方组,差异具有统计学意义(P0.05)。见表 1。表1 各组小鼠不同时间点体重变化(xs,n=10)g组别第 0 周第 6 周第 12 周正常对照组21.791.5322.570.9223.240.58假手术对照组21.282.3622.311.2722.711.24去势手术组21.351.1722.971.3524.961.10补肾壮骨方组21.571.1422.621.0423.111.01雌激素组21.561.1122.671.1024.680.62注:与正常对照组比较,P0.05;与
16、假手术对照组比,P0.05;与去势手术组比较,P0.05。2.2 各组小鼠血清性激素水平的比较去势手术组小鼠 FSH、LH 水平明显高于正常对照组、假手术对照组、补肾壮骨方组及雌激素组,差异具有统计学差异(P0.05);去势手术组小鼠血清 E2水平低于其他 4 组,差异具有统计学意义(P0.05);雌激素组 E2水平高于正常对照组、假手术对照组、补肾壮骨方及去势手术组,差异具有统计学意义(P0.05)。见表 2。表2 各组大鼠血清E2、FSH、LH含量的比较(xs,n=10)组别FSH/(ngmL-1)LH/(ngmL-1)E2/(pgmL-1)正常对照组370.277.903.320.331
17、8.000.78假手术对照组 380.668.103.260.2618.090.57去势手术组946.4141.879.230.5214.380.95补肾壮骨方组 400.2415.113.580.4117.711.00雌激素组399.4733.623.830.5820.311.83注:与正常对照组比较,P0.05;与假手术对照组比,P0.05;与去势手术组比较,P0.05。2.3 各组小鼠血清骨生化指标的比较去势手术组小鼠血清 ALP 明显高于正常对照组、假手术对照组、补肾壮骨方组及雌激素组,差异具有统计学差异(P0.05);去势手术组小鼠血清 Ca、P 含量明显低于其他 4 组(P0.05
18、)。见表 3。表3 各组小鼠血清骨生化指标的比较(xs,n=10)组别ALP/(UL-1)Ca/(mmolL-1)P/(mmolL-1)正常对照组2.030.182.460.273.350.15假手术对照组2.260.162.510.473.390.15去势手术组4.680.371.840.152.120.17补肾壮骨方组2.330.292.350.193.190.11雌激素组2.370.272.290.143.220.11注:与正常对照组比较,P0.05;与假手术对照组比,P0.05;与去势手术组比较,P0.05。2.4 补肾壮骨方对各组小鼠 BMD 及骨参数的影响去势手术组小鼠 BMD、B
19、V/TV、Tb.Th 低于正常对照组、假手术对照组、补肾壮骨方组及雌激素组,差异具有统计学意义(P0.05),补肾壮骨方组与雌激素组中 BMD、BV/TV 低于正常对照组与假手术组,差异具有统计学意义(P0.05)。见表4。表4 各组小鼠骨密度参数和骨结构参数的比较(xs,n=10)组别BMD/(gcm-2)BV/TV/%Tb.N/mmTb.Th/m正常对照组0.1180.00975.092.274.240.30108.382.60假手术对照组0.1160.00774.672.304.150.22108.012.33去势手术组0.0730.00546.561.474.480.2490.922.
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 补肾 壮骨方 通过 EphB4_Ephrin B2 缓解 绝经 骨质 疏松
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。