白芍总苷对过敏性紫癜小鼠Treg_Th17免疫平衡及JAK1_STAT3信号通路蛋白的影响.pdf
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1、中国免疫学杂志2023 年第 39 卷白芍总苷对过敏性紫癜小鼠Treg/Th17免疫平衡及JAK1/STAT3信号通路蛋白的影响周丽娟 单馨慧 胥卫青 金丹凤 毛 雯 袭雷鸣(青岛市海慈医疗集团儿一科,青岛 266033)中图分类号 R915 文献标志码 A 文章编号 1000-484X(2023)08-1660-05摘要 目的:基于蛋白酪氨酸激酶1/信号转导因子3(JAK1/STAT3)信号通路探讨白芍总苷对过敏性紫癜小鼠Treg/Th17免疫平衡的影响。方法:动物实验分为对照组、模型组、实验组、抑制剂组,模型组、实验组、抑制剂组小鼠尾静脉注射印度墨水及灌胃麦角蛋白复制过敏性紫癜模型,实验组
2、、抑制剂组小鼠每日灌胃0.1 g/kg白芍药总苷和AG490,连续处理4周。ELISA测定各组小鼠血清IL-10及IL-17含量;流式细胞术检测各组小鼠血清Treg、Th17变化;Western blot检测各组小鼠皮肤和肾脏组织p-JAK1、p-STAT3表达。结果:与对照组相比,模型组、实验组、抑制剂组小鼠血清Treg占CD4+T细胞比例和IL-10含量明显下降,Th17占CD4+T细胞比例、IL-17含量以及小鼠皮肤和肾脏组织p-JAK1、p-STAT3表达明显升高(均P0.05);与模型组相比,实验组、抑制剂组小鼠血清Treg占CD4+T细胞比例和血清IL-10含量明显升高,Th17占
3、CD4+T细胞比例、IL-17含量以及小鼠皮肤和肾脏组织p-JAK1、p-STAT3表达明显降低(均P0.05)。结论:白芍总苷可通过抑制JAK2/STAT3信号通路调控过敏性紫癜小鼠Treg/Th17免疫平衡。关键词 白芍总苷;过敏性紫癜;蛋白酪氨酸激酶1/信号转导因子3信号通路;Treg/Th17免疫平衡Effects of total glucosides of paeoniae on Treg/Th17 immune balance and JAK1/STAT3 signaling pathway protein in henoch purpura miceZHOU Lijuan,SH
4、AN Xinhui,XU Weiqing,JIN Danfeng,MAO Wen,XI Leiming.Department of Pediatrics,Qingdao Haici Medical Group,Qingdao 266033,ChinaAbstract Objective:To investigate effect of total glucosides of paeoniae on immune balance of Treg/Th17 in mice with henoch purpura via janus kinase 1/signal transducer and ac
5、tivator of transcription3(JAK1/STAT3)signal pathway.Methods:Animal experiments were divided into control group,model group,experimental group and inhibitor group.Mice in model group,experimental group and inhibitor group were injected with Indian ink in tail vein and gavaged ergotin to replicate all
6、ergic purpura model.Mice in experimental group and inhibitor group were given 0.1 g/kg total glucosides of paeoniae and AG490 daily for 4 weeks.ELISA was used to determine serum IL-10 and IL-17 levels of mice in each group;flow cytometry was used to detect changes of serum Treg and Th17 in each grou
7、p;Western blot was used to detect expressions of p-JAK1 and p-STAT3 of skin and kidney tissues in each group of mice.Results:Compared with control group,proportion of Treg in CD4+T cells and content of IL-10 in serum of mice in model group,experimental group and inhibitor group were decreased signif
8、icantly,proportion of Th17 in CD4+T cells and content of serum IL-17,expressions of p-JAK1 and p-STAT3 in skin and kidney tissues were significantly increased(all P0.05).Compared with model group,proportion of Treg in CD4+T cells and content of serum IL-10 of mice in experimental group and inhibitor
9、 group were increased significantly,proportion of Th17 in CD4+T cells and content of IL-17 in serum,expressions of p-JAK1 and p-STAT3 in skin and kidney tissues were decreased significantly(all P0.05).Conclusion:Total glucosides of paeoniae can regulate immune balance of Treg/Th17 in henoch purpura
10、mice by inhibiting JAK2/STAT3 signal pathway.Key words Total glucosides of paeoniae;Henoch purpura;JAK1/STAT3 signal pathway;Treg/Th17 immune balance过敏性紫癜被称为舒-亨综合征,是一种常见的系统性血管炎,迁延难愈,易反复发作,严重影响患儿学习状态及身心健康,发病率呈逐年升高趋势1。过敏性紫癜病因处于研究阶段,尚无根治性治疗措施,目前仅能依靠控制患者炎症放大及提高患者自身免疫功能改善临床症状2。蛋白酪氨酸激酶1/信号转导因子 3(janus kin
11、ase 1/signal transducer and activator of transcription 3,JAK1/STAT3)是体内重要的与炎症应激和免疫调节密切相关的通路。峰淼等3研究显示关节炎等大鼠模型中,机体进行炎症doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2023.08.017青岛市海慈医疗集团儿二科,青岛 266033。通信作者,青岛市海慈医疗集团中医儿科,青岛 266033,E-mail:。山东省中医院儿内科,济南 250011。作者简介:周丽娟,女,硕士,主治医师,主要从事中西医结合治疗 小儿肾脏疾病方面的研究。1660周丽娟等 白芍总苷对过敏性紫癜小鼠
12、Treg/Th17免疫平衡及JAK1/STAT3信号通路蛋白的影响 第 8 期应激时,JAK1、STAT3被激活发生磷酸化,促进促炎因子合成与释放,导致Treg/Th17免疫失衡,促进关节炎发展。Treg/Th17免疫平衡是细胞免疫功能的重要组成,Treg在Foxp3诱导下释放IL-10等抑炎因子,减缓炎症应激进展,而Th17特异性激活转录因子维甲酸相关核孤儿受体t(retinoid-related orphan receptor t,RORt)促进IL-17等促炎因子合成与分泌4。该通路及 Treg/Th17在过敏性紫癜中的作用报道较少。白芍总苷是中药白芍的主要活性成分,具有抗炎、抗疼痛和免
13、疫调节作用。邵宽芙蓉等5研究显示白芍总苷治疗过敏性紫癜肾炎疗效显著,不良反应较少,但未深入揭示药物的作用机制。本研究通过复制过敏性紫癜小鼠模型,从JAK1/STAT3信号角度探讨白芍总苷对过敏性紫癜小鼠 Treg/Th17 免疫平衡的影响,以期为疾病临床治疗提供参考。1 材料与方法 1.1材料1.1.1实验动物40 只 810 周龄 SPF 级雄性C57BL/6小鼠,体质量(223)g,购自山东烟台百吉林生命科学研究院,使用许可证号:SYXK(鲁)2019-0002。所有实验动物均在青岛市海慈医疗集团SPF级动物房进行,12 h明/12 h暗循环,(202),(4510)%湿度,自由摄食饮水,
14、适应性喂养1周后用于后续实验。本研究经青岛市海慈医疗集团动物伦理委员会批准(批号:YL20201203),所有操作均在青岛市海慈医疗集团 关于实验动物的使用与护理的指南建议 指导下进行,实验过程中尽量减少动物疼痛及伤亡,给予动物人道主义关怀。1.1.2主要试剂与仪器白芍总苷胶囊(0.3 g180 s,宁 波 立 华 制 药 有 限 公 司,国 药 准 字H20055058);JAK1特异性抑制剂AG490(德国Med Chem Express 公司);p-JAK1、p-STAT3 单克隆抗体(碧云天生物技术有限公司);HE 试剂盒、Western blot试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);PB
15、S(武汉普诺赛生命科技有限公司);台式离心机(德国Storius公司);光学显微镜(日本Olympus公司);凝胶成像系统及垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司);超净工作动台(北京六一仪器厂);电子天平(江苏太仓实验设备厂)。1.2方法1.2.1过敏性紫癜动物模型复制及分组处理6采用6 mmol/L HCl将麦角蛋白配制为0.1%溶液备用。实验小鼠经适应性喂养后随机分为对照组、模型组、实验组、抑制剂组,模型组、实验组、抑制剂组小鼠尾静脉注射40 mg/kg印度墨水,1次/周,连续3周,灌胃0.5 ml麦角蛋白溶液,2 d/次,连续14周;对照组小鼠不进行尾静脉注射,灌胃6 mmol/L HCl
16、溶液。第14周末采集模型组及对照组小鼠股静脉血各 1 ml,沉淀比浊法检测循环免疫复合物蛋白(circulating immune complex,CIC)水平,CIC水平高于对照组则造模成功。采用生理盐水将白芍总苷和AG490配制为0.1 g/kg稀释液,造模成功后,实验组、抑制剂组小鼠每日灌胃0.1 g/kg白芍药总苷和AG490,1次/d,对照组和模型组小鼠灌胃等剂量生理盐水,连续处理4周后取材检测相应指标。1.2.2小鼠网状内皮系统(reticuloendothelial system,RES)吞噬功能比较4周药物干预后,再次测量各组小鼠血清CIC水平,小鼠尾静脉注射印度墨汁,碳粒廓清
17、实验检测小鼠MPS变化7:尾静脉注射0.05 ml/10 g(以小鼠体质量计算)稀释的印度墨汁,注射后 2 min(t1)、12 min(t2)取静脉血 0.02 ml,转移至含 2 ml 0.1%Na2CO3的EP管,轻微摇晃混匀,以0.1%Na2CO3 作为比色调零点,分光光度计检测640 nm处光密度(D),称取小鼠体质量,处死后再称取各组小鼠肝脏及脾脏组织质量。吞噬指数 K=(IgD1IgD2)/(t2t1),吞噬系数=K1/3体质量/(肝脏质量+脾脏质量)。1.2.3小鼠皮肤及肾脏组织病理变化比较药物干预 4周后处死小鼠,收集各组小鼠皮肤(病灶位置)及肾脏组织,固定、脱水、包埋,制成
18、5 m切片,HE染色,封片,显微镜下观察小鼠皮肤及肾脏组织病理变化。1.2.4小鼠血清 IL-10及 IL-17含量比较经 4周药物干预后,取各组小鼠静脉血4 ml,离心,取50%上清,ELISA测定小鼠血清IL-10及IL-17含量。1.2.5小鼠血清 Treg、Th17 变化将各组小鼠50%血清上清制成单细胞悬液,取100 l单细胞悬液进行染色、避光孵育,PBS洗涤,流式细胞仪测定各组小鼠血清Treg、Th17计数变化。1.2.6 小 鼠 皮 肤 和 肾 脏 组 织 Foxp3 和 RORt mRNA 表达提取各组小鼠皮肤和肾脏组织总RNA,测定其完整性后以PrimeScript RT试剂
19、盒合成cDNA,按PCR仪要求进行扩增8。以GAPDH为参照,各基因序列为GAPDH F:5-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3,R:5-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3;Foxp3 F:5-GTATTTCGTAGGACAGG-3,R:5-CAG1661中国免疫学杂志2023 年第 39 卷TACTGTGATAACTGAA-3;RORt F:5-TGATGAC-ATCAAGAAGGTGGTGAAG-3,R:5-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3。以2Ct表示基因相对表达。1.2.7小鼠皮肤和肾脏组织 p-JAK1、p-STAT3 表达取各组小鼠皮肤和肾脏组
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