NY∕T 3278.1-2018 微生物农药 环境增值试验准则 第1部分:土壤(农业).pdf
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1、, ICS 65.020 B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准NY/T 3278.1一2018微生物农药环境增殖试验准则第1部分:土壤Environmental reproduction test guidelines for microbial pesticides-Part 1 :Soil 2018-07 -27发布2018 -12 -01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T 3278. 1-2018 剧昌NY/ T 3278 (微生物农药环境增殖试验准则),分为3个部分:一一第1部分:土壤;一一第2部分:水;一一第3部分:植物叶面。本部分为NY/T3278的第1部分。本部分按照
2、GB/T1. 1-2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由农业农村部种植业管理司提出并归口。本部分起草单位:农业农村部农药检定所、环境保护部南京环境科学研究所。本部分主要起草人:卡元卿、周欣欣、单正军、朱旦璇、袁善奎、姜辉、张燕宁、张兰。I 范围微生物农药环境增殖试验准则第1部分:土壤本部分规定了微生物农告等的基本要求。本部分适用于2 下列文件对件。凡是不注日GB 7172 GB 15618 3 术语下列术3.1 微生物农NY/T 3278. 1-2018 据处理、质量控制、试验报以细菌、真回回日在二二哥黯韬隘亟章程髓摇摇能
3、GA病、虫、草、鼠等有害生3.2 供试物test 试验中需要测3.3 菌落形成单位由单个菌体或聚集3.4 细菌芽抱bacterial spore 某些细菌在其生长发育后期,在细胞内眠体。3.5 真菌抱子fungaI spore 真菌的主要繁殖器官。分为有性抱子和元性抱子两大类。抱子在适宜条件下发芽,形成菌丝而进行分裂繁殖;当外界环境不适宜时,可以呈休眠状态长时间生存。3.6 细菌抱囊bacterial cyst 某些细菌尤其是一些固氮菌在外界缺乏营养的条件下,由整个营养细胞外壁加厚、细胞失水而形成的一种抗干旱但不抗热的圆形休眠体。1 NY/T 3278. 1-2018 3.7 原生动物抱囊pr
4、otozoan cyst 某些原生动物在外界环境不利条件下,形成的能高度抵抗干旱、冰冻和高温的休眠体。3.8 细菌营养体vegetative bacterium 单个活的生物体,通常是指能在合适的培养基上形成一个CFU的实体。3.9 原生动物protozoa 最原始、最低等的单细胞动物。原生动物除了具有真核细胞的一般特征(具细胞膜、细胞核和细胞质等)外,其细胞本身是一独立完整的有机体,通过细胞内和细胞表面的一些特殊细胞器来完成运动、营养和生殖等生命活动。3. 10 宿存sun唯val具有活性的微生物在施用后的一段时间内可在动物、土壤或植物内体或表面保持活性的状态。3. 11 增殖multipl
5、ication 微生物生长到一定阶段,由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体,即引起生命个体数量增加的生物学过程。3. 12 延滞期lag phe 少量微生物接种到新鲜培养基后,在开始培养的一段时间内,因代谢系统适应新环境的需要,微生物数目没有增加的一段时期。3. 13 指数期log phase 在生长曲线中,紧接着延滞期的一段微生物数量以几何级增长的时期。3. 14 稳定期stationary phase 新增殖的微生物数量与衰亡的微生物数量相等的时期,这个时期的菌体数量达到最高。3. 15 衰亡期death ph描e微生物的个体死亡速度超过新增殖速度,整个群体呈现负生长状态
6、的时期。4 试验概述将供试物接种到元菌土壤中,在适宜的条件下培养,定时取样测定其数量,得到供试物在土壤中的动态变化。5 试验方法5. 1 材料和条件5. 1. 1 试验用土推荐黑土作为试验用土,或采用供试物拟施用地区土壤作为试验用土,试验用土满足GB15618二级标准的要求。取土壤表面以下ocm20 cm的新鲜土样,封口带回实验室,除去粗大枝叶、动物躯壳等,风干保藏。风干土壤含水量测定按照GB7172的规定执行。风干土壤研磨过0.42mm筛,用自来, NY/T 3278. 1-2018 水调节土壤含水量为最大田间持水量的40%60%。然后每份100g分装人500mL锥形瓶,至少8份,1210C
7、灭菌25min30 min。5. 1.2 供试物5. 1. 2. 1 类型供试物包括微生物农药母药、制剂产品。5. 1.2.2 批次试验中供试物应采用同一批次的产5. l. 3 主要仪器设备超净工作台。灭菌锅。显微镜。分光光度计。荧光定量温度计。天平。5. 2. l. 1 5.2.4 取样与存放自接菌后第1d开始取样,试。4d后,每隔1d取一次样品。. 菌水补充失水量。试验期间,维持土壤含水间可根据供试物的生长情况调整。样品40C保存。5. 2. 5 计数方法5.2.5. 1 细菌、放线菌、真菌、酵母以根据推荐的菌液。土壤充分混合均、氧气、光照等培养品各1.0 g,进行计数测次取样后质量差量为
8、失水量,元的40%60%。取样量和取样间隔时以CFU为计数单位,可采用稀释平板菌落计数法(参见附录A)、绿色荧光蛋白基因标记-平板计数法(参见附录B)测定。以基因拷贝数为计数单位,可采用分子标记-荧光定量PCR法(参见附录C)测定。5. 2. 5. 2 原生动物、真菌抱子、酵母以个体数目为计数单位,可采用直接计数法(参见附录D)等测定。5. 2. 6 试验周期3 NY/T 3278. 1-2018 试验持续时间应能够反映供试物的延滞期、指数期、稳定期和衰亡期;或在28d内持续检测确认供试物含量维持稳定或显著低于接种量,则可结束试验。5. 2. 7 生长-消亡曲线以培养时间为横坐标、以供试物含量
9、的对数为纵坐标做图,绘出供试物的生长-消亡曲线。5. 3 数据处理5.3. 1 独立样本t检验2组均值比较时可进行独立样本t检验。独立样本t检验按式(1)计算。式中:瓦,王;一一分别为两样本平均数;31,iz一一分别为两样本方差;n 一一样本容量。5.3.2 单因子方差分析(One-Way ANOVA) 3组及以上均值比较时可进行方差分析。单因子方差分析LSD检验按式(2)计算。. (1) LSD. = t.(df.) S王27(2)式中:t.(df.)一-在F检验中误差自由度下,显著水平为的临界t值;S-一一均数差异标准误,按式(3)计算。式中:MS.一-F检验中误差均方; 一-各处理重复数
10、。S一可= J2MS./ n . (3) 5. 4 质量控制第Od时灭菌土壤不得检出微生物活菌。使用荧光定量PCR法计数微生物数量时,扩增效率的范围应为90%1l0%。6 试验报告试验报告应至少包括下列内容:a) 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号;b) 试验委托单位和联系方式、样品受理日期和封样情况;c) 试验开始和结束日期、试验项目负责人、试验单位技术负责人、签发日期;d) 供试物基本信息(如含量和组成信息,以及任何改变供试物生物活性物质的含量和组成信息、施用量、施用方法等); e) 试验系统的详细描述;f) 试验条件,包括试验土壤含水量、pH、有机质含量、温度、光照等;g) 试验
11、结果,绘制供试物的生长一消亡曲线。4 、A. 1 方法原理将土壤样品经无菌落,根据形成的菌A.2 试剂A. 2.1 A. 2. 2 A. 2. 3 A. 2. 4 A. 2. 5 A. 2. 6 A. 2. 7 A. 2. 8 A. 2. 9 A.2.10 A. 2.11 A. 2.12 A. 2.13 吐温80。A. 2.14 孟加拉红。A. 2.15 氯霉素。A. 2.16 氢氧化铀溶液:1 A. 2.17 盐酸溶液:1mol/L。A. 2.18 琼脂。注:以上化学试剂均为分析纯。A.3 仪器设备A. 3.1 高压蒸汽灭菌锅。A. 3. 2 恒温培养箱。A.3. 3 超净工作台。A. 3.
12、 4 酸度计等。NY/T 3278. 1-2018 附录A(资料性附录)稀释平板菌落计数法生长并繁殖成一个菌5 NY/T 3278. 1-2018 A.4 固体培养基平板的制备1)A. 4. 1 细菌培养基平板用于细菌的培养。称取蛋白陈10g、牛肉浸膏3g、氯化锅5g、琼脂粉15g18g,于900mL蒸馆水中,煮沸搅拌至完全溶解,加蒸馆水补足至1000mL。以1mol/L氢氧化锅溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07. 2。分装于500mL三角瓶中,每瓶200mL, 121 oC高压灭菌20min30 min。培养基温度降至约500C后倒人直径为9cm的元菌培养皿中,每板约15mL。A.
13、 4. 2 高氏1号培养基用于放线菌的培养。称取可溶性淀粉20g、硝酸饵1g、氯化铀0.5g、磷酸氢二饵0.5 g、七水硫酸镜0.5g、七水硫酸亚铁0.01g、琼脂粉1 5g,于900mL蒸馆水中,煮沸搅拌至完全溶解,加蒸馆水补足至1000mL。以1mol/L氢氧化铀溶液或1mol/L盐酸溶液调节pH至7.07. 2。分装于500mL =: 角瓶中,每瓶200mL, 121 oC高压灭菌20min30 min。培养基温度降至约500C后倒人直径为9cm的无菌培养皿中,每板约15mL。A. 4. 3 孟加拉红培养基用于酵母菌和真菌的培养。称取蛋白陈5g、葡萄糖10g、磷酸二氢梆1g、硫酸镜0.5
14、g,琼脂粉15 g18 g、孟加拉红0.03g,于900mL蒸馆水中,煮沸搅拌至完全溶解,加蒸馆水至1000mL。分装于500 mL三角瓶中,每瓶200mL, 1210C高压灭菌20min 30 min。培养基温度降至约500C后,按照1000 mL中含有氯霉素0.1g的比例加人氯霉素,轻摇混匀,倒人直径为9cm的无菌培养皿中,每板约15 mL。A. 4. 4 酵母培养基用于酵母菌的培养。称取酵母膏3g、麦芽汁3g、蛋白陈5g、葡萄糖10g、琼脂粉20g,于900mL 蒸馆水中,煮沸搅拌至完全溶解,加蒸馆水至1000mL。分装于500mL三角瓶中,每瓶200mL, 121 oC 高压灭菌20m
15、in30 mino培养基温度降至约500C后倒入直径为9cm的无菌培养皿中,每板约15mL。A.5 土壤样品的处理称取1.0g新鲜土样,加人盛有9mL元菌水或0.05%吐温80溶液的三角瓶中,定容至10mL,振荡10min使土壤充分分散,即成10-1土壤悬液。A.6 样品的稀释涂布用元菌刻度吸管吸取1mL上述10-1土壤悬液到9mL无菌水中,充分振荡,即成10-2土壤悬液。按此方法逐步稀释,通常稀释到10 -6。根据土壤中微生物的数量选择合适倍数的悬液接种,细菌一般采用10-6 10-4土壤悬液用于平板涂布;真菌一般10-31O-1土壤悬液用于平板涂布。吸取100L土壤悬液置于培养基平板表面,
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