吡咯啉-5-羧酸合成酶在人肝癌组织中表达及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用观察.pdf
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1、山东医药2023 年第 63 卷第 30 期吡咯啉-5-羧酸合成酶在人肝癌组织中表达及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用观察张玉衡,陈鸣,曹科,王刚,朱章华,虞文魁南京大学医学院附属鼓楼医院重症医学科,南京210009摘要:目的观察吡咯啉-5-羧酸合成酶(Pyrroline-5-carboxylate synthase,P5CS)在肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)组织中的表达变化及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用。方法HCC及癌旁组织P5CS检测:选择10例HCC患者的癌组织及癌旁组织,采用免疫组化法检测HCC及癌旁组织P5CS蛋白;P5CS对人肝癌细胞系Li
2、-7、Huh-7铁死亡的调控作用观察:取对数生长期Li-7、Huh-7,用siALDH18A1 乙醛脱氢酶家族18成员A1(ALDH18A1)可编码P5CS蛋白 转染细胞,采用qRT-PCR法检测转染前后Li-7及Huh-7细胞脂质过氧化物合成相关基因ACSL4、LPCAT3、LOX-15,采用WESTERN Blotting法检测转染前后Li-7及Huh-7细胞铁死亡相关蛋白溶质载体家族 7 成员 11(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)。取转染前后 Li-7 及 Huh-7 细胞各分为 2 组,分别加入5 mol/L的铁死亡诱导剂Erastin、同体积DMSO,采用C11-B
3、ODIPY荧光探针检测各组细胞脂质过氧化物含量。取转染前、后Li-7及Huh-7细胞各分为2组,分别加入5 mol/L的GPX4靶向抑制剂RSL-3、5 mol/L的Erastin、同体积DMSO,采用C11-BODIPY荧光探针检测各组细胞脂质过氧化物含量。结果HCC及癌旁组织P5CS蛋白相对表达量分别为6.80 2.10、0.40 0.20,二者比较,P0.05。与转染前比较,转染后Li-7及Huh-7细胞SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量低(P均0.05)。与转染前比较,转染后加入Erastin、RSL-3的Li-7、Huh-7 细胞脂质过氧化物含量均升高(P均0.05)。与加入Er
4、astin者比较,转染后加入RSL-3的Li-7、Huh-7 细胞脂质过氧化物含量高、细胞活性低(P均0.05)。结论HCC组织中P5CS表达升高。P5CS可抑制Li-7及Huh-7细胞的铁死亡,P5CS可能通过抑制细胞GPX4表达,调控Li-7及Huh-7细胞的铁死亡。关键词:吡咯啉-5-羧酸合成酶;铁死亡;谷胱甘肽过氧化物酶4;肝肿瘤;肝细胞癌doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2023.30.003 中图分类号:R735.7 文献标志码:A 文章编号:1002-266X(2023)30-0011-05Expression of pyrroline-5-carboxy
5、late synthase in hepatocellular carcinoma tissues and its regulatory effect on ferroptosis in human hepatoma cell linesZHANG Yuheng,CHEN Ming,CAO Ke,WANG Gang,ZHU Zhanghua,YU WenkuiDepartment of Intensive Care Unit,The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210009,ChinaAbst
6、ract:Objective To observe the expression changes of pyrroline-5-carboxylate synthase(P5CS)in hepatocellular carcinoma(HCC)tissues and its regulatory effect on ferroptosis in human hepatoma cell lines.Methods Detection of P5CS in HCC and adjacent tissues:The cancer tissues and adjacent tissues of 10
7、patients with HCC were collected,and P5CS was detected by immunohistochemistry.The regulatory effect of P5CS on ferroptosis of human hepatoma cell lines Li-7 and Huh-7:Human hepatoma cell lines Li-7 and Huh-7 in the logarithmic growth phase were transfected with siALDH18A1(targeting P5CS coding gene
8、 ALDH18A1).Before and after the transfection of siALDH18A1 in Li-7 and Huh-7 cells,qRT-PCR was used to detect the expression levels of ACSL4,LPCAT3 and LOX-15 genes related to lipid peroxide synthesis,and Western blotting was used to detect the content of ferroptosis-related protein solute carrier f
9、amily 7 member 11(SLC7A11)and glutathione peroxidase(GPX4).Li-7 and Huh-7 cells with or without siALDH18A1 transfection were divided into two groups,and 5 mol/L Erastin or the same volume of DMSO were added,respectively.The content of lipid peroxide in each group was detected by C11-BODIPY fluoresce
10、nt probe.Another group of cells with or without siALDH18A1 transfection were divided into two groups,and 5 mol/L GPX4 targeted inhibitor RSL-3,5 mol/L Erastin or 基金项目:国家重大科研仪器研制项目(81927808);国家自然科学基金青年基金项目(82002082)第一作者简介:张玉衡(1991-),男,博士研究生在读,主要研究方向为细胞死亡与肿瘤。E-mail:开放科学(资源服务)标识码(OSID)11山东医药2023 年第 63
11、卷第 30 期the same volume of DMSO were added,respectively.The content of lipid peroxide in each group was detected by C11-BODIPY fluorescent probe.Results The expression of P5CS protein of HCC and adjacent tissues were 6.80 2.10 and 0.40 0.20,respectively(P0.05).The relative expression levels of SLC7A1
12、1 and GPX4 protein were lower in comparison with those before inhibition(both P0.05).Compared with those before inhibition,the lipid peroxide content in Li-7 and Huh-7 cells added with Erastin or RSL-3 after transfection increased(all P0.05).The lipid peroxide content of Li-7 and Huh-7 cells added w
13、ith RSL-3 after transfection was higher and the cell activity was lower in comparison with those of cells added with Erastin(all P0.05).Conclusions P5CS was highly expressed in HCC tissues.P5CS inhibits ferroptosis of Li-7 and Huh-7 cells possibly by inhibiting GPX4 expression.Key words:pyrroline-5-
14、carboxylate synthase;ferroptosis;glutathione peroxidase 4;liver neoplasms;hepatocellular carcinoma肝癌是世界第六大常见的恶性肿瘤。单独应用靶向药物治疗晚期肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的效果不佳,部分患者在治疗后发生耐药1-2。因此,探索HCC的细胞耐药机制是目前的研究重点与难点。铁死亡是一种新发现的调节性细胞死亡形式,主要表现为铁催化的脂质过氧化物对细胞各类膜结构的破坏,被以还原性谷胱甘肽(Glutathione,GSH)-谷胱甘肽过氧化物酶(Glutath
15、ione peroxidase 4,GPX4)为主的抗氧化系统负性调控3。研究4发现,索拉非尼等靶向药物在诱导HCC肿瘤细胞凋亡、抑制血管新生的同时,还可抑制肿瘤细胞脂质过氧化物的产生、上调抗抗氧化系统 GSH-GPX4的活性,抑制HCC细胞铁死亡,最终导致肿瘤耐药。吡咯啉-5-羧酸合成酶(Pyrroline-5-carboxylate synthase,P5CS)是催化脯氨酸合成的限速酶之一,除催化合成作用外还能维持细胞内GSH含量,从而保护肿瘤细胞免受氧化应激损伤,具有潜在的抗氧化作用5。P5CS可通过增加脯氨酸的合成,促进肿瘤的发生发展,但具体作用机制尚不明确6。P5CS是否通过调控肝癌
16、细胞的铁死亡影响细胞耐药,目前相关研究较少。为此,2023年1-6月,我们观察了P5CS在HCC组织中的表达及其对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用,进一步探讨其可能作用机制,现报告如下。1 材料与方法 1.1HCC癌组织及癌旁组织P5CS检测2020年9月2021年 9月间于南京鼓楼医院就诊的 HCC患者10例。患者纳入标准:结合临床表现、影像学诊断(B 超/增强 CT 或 MRI)和血清 AFP 检测(400 g/L)临床确诊为HCC;术前未经放疗、化疗和靶向治疗;不伴有其他类型肝占位、肝内胆管结石等。排除标准:不愿意接受手术治疗或出现肝内/肝外广泛转移,暂无法进行手术治疗;肝功能和/或其他脏器
17、功能出现严重不全,无法耐受手术治疗;术后病理证实为非HCC的其他类型肝癌。10例患者均留取HCC组织和对应癌旁组织(5 cm)标本,并对标本的使用知情同意。取 HCC 及癌旁组织,固定后石蜡包埋切片,Triton-X通透组织细胞后封闭非特异性抗原,anti-P5CS一抗孵育,4 过夜。次日孵育二抗并滴加DAB显色剂,苏木素复染后封片观察。染色强度为阴性计0分、弱阳性计1分、阳性计2分、强阳性计3分;阳性染色细胞(阳性、强阳性染色强度细胞)百分比为25%者计1分、26%50%者计 2 分、51%75%者计 3 分、76%100%者计 4分;以染色强度、阳性染色细胞百分比相加为 P5CS 的蛋白的
18、相对表达量。重复测算 3 次,取平均值。1.2P5CS 对人肝癌细胞系铁死亡的调控作用观察1.2.1细胞、试剂及仪器人肝癌细胞系 Li-7、Huh-7 购自中国科学院上海细胞库;Huh-7 在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养,Li-7在含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养,置于37、含5%CO2的细胞培养箱内。siALDH18A1乙醛脱氢酶家族18成员A1(ALDH18A1)基因可编码 P5CS 蛋白,基因序列 GTTCGTTCTTGGAGCAACA 购自广州锐博生物;逆转录及荧光定量PCR试剂盒购自武汉赛维尔公司;qPCR所需引物购自北京擎科生物,具体序列GAPDH
19、基因qPCR引物正向序列 TCAAGGCTGAGAACGGGAAG、反 向 序 列 TCGCCCCACTTGATTTTGGA,ALDH18A1 基 因 qPCR引物正向序列 GCCCTTCAACCAACATCTTCT、反向序列 AGGGGTACAGTGATAAACGGG,ACSL4 基因qPCR 引物正向序列 GCTATCTCCTCAGACACACCGA、反向序列 AGGTGCTCCAACTCTGCCAGTA,LPCAT3 基因 qPCR 引物正向序列 GGAGCTGAGCCT12山东医药2023 年第 63 卷第 30 期TAACAAGTT、反 向 序 列 CAAAGCAAAGGGGTAAC
20、CCA,15-LOX 基 因 qPCR 引 物 正 向 序 列 ACC TTCCTGCTCGCCTAGTGTT、反 向 序 列 GGCTACAGAGAATGACGTTGGC。一抗(anti-P5CS、anti-actin、anti-SLC7A11、anti-GPX4)及二抗(羊抗鼠、羊抗兔)购自美国Proteintech公司;CCK8试剂盒购自武汉赛维尔公司;细胞活性氧簇(ROS)检测试剂盒、转染试剂 Lipo8000购自碧云天生物公司;C11-BODIPY染料购自美国Thermo Fisher公司;SLC7A11靶向抑制剂Erastin、GPX4靶向抑制剂RSL-3购自美国Selleck公司
21、。1.2.2Li-7、Huh-7 细胞培养及 siALDH18A1 转染方法取接种于6孔板内的对数生长期 Li-7、Huh-7细胞,按说明书将适量Lipo8000和siALDH18A1混合,室温孵育15 min后转染细胞,控制siALDH18A1终浓度为50 nmol/L。继续培养48 h后TRIzol提取总RNA,采用qPCR法检测细胞ALDH18A1 mRNA,与转染前比较,转染48 h时Li-7、Huh-7细胞中ALDH18A1 mRNA 相对表达量减少至 27.10 13.30、30.20 3.60(P0.05),采用 WESTERN Blotting 法检测转染前后 Li-7、Huh
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