补气益精生血中药对人红系细胞组蛋白修饰酶的影响.pdf
《补气益精生血中药对人红系细胞组蛋白修饰酶的影响.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《补气益精生血中药对人红系细胞组蛋白修饰酶的影响.pdf(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、实验论著补气益精生血中药对人红系细胞组蛋白修饰酶的影响陈珏璇,徐方蔚,卢焯明基金项目:广东省中医药局科研项目();广州市妇女儿童医疗中心内部基金(NK E P R E )作者单位:广州,广州市妇女儿童医疗中心作者简介:陈珏璇(),女,医学硕士,主治医师.研究方向:中药、针灸结合治疗儿童疾病通讯作者:卢焯明,E m a i l:q q c o m【摘要】目的观察补气益精生血中药对人红系K 细胞株组蛋白修饰酶的影响.方法运用补气益精生血、补气生血、益精生血的中药分别以高、低浓度对K 细胞株进行诱导,并以丁酸钠作阳性对照.以实时荧光定量聚合酶链式反应(P C R)检测细胞珠蛋白基因基因mR NA水平
2、,采用酶标仪以比色法检测细胞组蛋白脱乙酰基酶(HD A C、HD A C),组蛋白乙酰基转移酶(HA T)酶活性水平,P C R方法检测HDA C、HDA C、HA T基因m R NA水平,W e s t e r nB l o t方法检测HD A C、HD A C、HA T蛋白水平.结果补气益精高剂量组、补气高剂量组、益精低剂量组中药及丁酸钠均显著提升了珠蛋白基因表达水平.补气益精高、低剂量组及益精高、低剂量组的细胞HA T酶活性水平均显著高于空白对照组,而丁酸钠组的HD A C 酶活性水平则显著低于空白对照组.对于HA T基因的m R NA水平,补气益精高、低剂量组,益精高剂量组显著高于空白
3、对照组.W e s t e r nB l o t结果则只有补气益精高剂量组和益精高剂量组的HA T蛋白水平显著高于空白对照组.结论补气益精生血中药可能通过上调HA T基因的表达进而促进红系细胞内珠蛋白基因启动子区组蛋白的乙酰化修饰,其诱导珠蛋白基因表达治疗儿童地中海贫血的分子机制可能与调节组蛋白修饰酶有关.【关键词】地中海贫血;中医药疗法;珠蛋白基因表达;组蛋白修饰d o i:/j i s s n 【中图分类号】R 【文献标识码】A【文章编号】()T h e i m p a c t o fB u q iY i j i n gS h e n g x u eC h i n e s eh e r b
4、 a lm e d i c i n e s o nh i s t o n e m o d i f y i n g e n z y m e s i nh u m a ne r y t h r o i dc e l l s CHENJ u e x u a n,XUF a n g w e i,L UZ h u o m i n gG u a n g z h o uW o m e na n dC h i l d r e n sM e d i c a lC e n t e r,G u a n g z h o u ,C h i n a【A b s t r a c t】O b j e c t i v eT h
5、 i ss t u d ya i m st oi n v e s t i g a t et h ei m p a c to fB u q iY i j i n gS h e n g x u eC h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e s,w h i c ha r ek n o w n f o r t h e i rg e n e r a t i n gb l o o db yt o n i f y i n gQ i a n db e n e f i t i n ge s s e n c ep r o p e r t i e s,o nh i s t o n
6、 e m o d i f y i n ge n z y m e s i n t h eh u m a ne r y t h r o i dK c e l l l i n e M e t h o d s K c e l l sw e r e i n d u c e dw i t hh i g ha n d l o wc o n c e n t r a t i o n so f s e v e r a l g r o u p so fC h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e s,i n c l u d i n gB u q iY i j i n gS h e
7、n g x u ed r u g s,B u q i S h e n g x u ed r u g s a n dY i j i n gS h e n g x u ed r u g s f o rb l o o dg e n e r a t i n g,a n ds o d i u mb u t y r a t ew a su s e da sap o s i t i v ec o n t r o l T h em R NAl e v e l so ft h e g l o b i ng e n ew e r ea s s e s s e du s i n gr e a l t i m ef
8、l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v eP C RA d d i t i o n a l l y,c e l l u l a rHD A C,HD A C,a n dHA Te n z y m ea c t i v i t y l e v e l sw e r ea n a l y z e du s i n ga ne n z y m em a r k e rb yc o l o r i m e t r i cd e t e c t i o nm e t h o d s T h em R NAl e v e l so fHD A C,HD A C
9、,a n dHA Tg e n e sw e r ed e t e r m i n e du s i n g t h eP C Rm e t h o d,w h i l ep r o t e i n l e v e l so f t h e s eg e n e sw e r ed e t e r m i n e dv i aW e s t e r nB l o t R e s u l t s T r e a t m e n tw i t hC h i n e s eh e r b a lm e d i c i n ea n ds o d i u mb u t y r a t es i g n
10、 i f i c a n t l yi n c r e a s e dt h ee x p r e s s i o nl e v e l so f t h e g l o b i ng e n e i nh i g h d o s eQ i t o n i f y i n ga n de s s e n c e b e n e f i t i n gg r o u p,h i g h d o s eQ i t o n i f y i n gg r o u p,a n dl o w d o s ee s s e n c e b e n e f i t i n gg r o u p C e l l
11、 u l a rHA T e n z y m ea c t i v i t yl e v e l sw e r en o t a b l yh i g h e r i nh i g ha n dl o w d o s eQ i t o n i f y i n ga n de s s e n c e b e n e f i t i n gg r o u p s,a sw e l la si nh i g ha n dl o w d o s ee s s e n c e b e n e f i t i n gg r o u p st h a ni nb l a n kc o n t r o lg
12、r o u p,w h i l eHD A C e n z y m ea c t i v i t yl e v e l si nt h es o d i u mb u t y r a t eg r o u pw e r em a r k e d l yl o w e rt h a nt h o s er e c o r d e di nt h eb l a n kc o n t r o lg r o u p HA TmR NAl e v e l s中国中西医结合儿科学 年 月第 卷第期C h i nP e d i a t r I n t e g rT r a d i tW e s tM e d
13、,O c t ,V o l ,N o w e r en o t a b l yh i g h e r i nh i g ha n d l o w d o s eQ i t o n i f y i n ga n de s s e n c e b e n e f i t i n gg r o u p s,a sw e l l a s i nh i g h d o s ee s s e n c e b e n e f i t i n gg r o u pt h a ni nb l a n kc o n t r o lg r o u p W e s t e r nB l o to u t c o m
14、e sd e m o n s t r a t e dt h a to n l yt h eHA Tp r o t e i n l e v e l s i nt h eh i g h d o s eQ i t o n i f y i n ga n de s s e n c e b e n e f i t i n gg r o u pa n dh i g h d o s ee s s e n c e b e n e f i t i n gg r o u pw e r ec o n s i d e r a b l ye l e v a t e dc o m p a r e dt ot h o s e
15、 i nt h eb l a n kc o n t r o lg r o u p C o n c l u s i o nT h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo fB u q iY i j i n gS h e n g x u eC h i n e s eh e r b a lm e d i c i n e s i nt h e i n d u c t i o no f g l o b i n i ng e n ee x p r e s s i o ni nt h e t r e a t m e n t o f p e d i a t r i c t h
16、 a l a s s e m i am a yb e r e l a t e d t o t h e r e g u l a t i o no f t h eh i s t o n e m o d i f y i n ge n z y m e,w h i c hm a yb em e d i a t e db yu p r e g u l a t i n g t h e e x p r e s s i o no f h i s t o n e a c e t y l t r a n s f e r a s eHA Tt oe n h a n c eh i s t o n em o d i f
17、i c a t i o n i ne r y t h r o i dc e l l s【K e y w o r d s】t h a l a s s e m i a;T CMt h e r a p y;g l o b i ng e n ee x p r e s s i o n;H i s t o n em o d i f i c a t i o n地中海贫血在我国南方及多个热带亚热带国家高发,严重危害儿童健康 .目前的婚检产检手段对于家族史不详的轻型地中海贫血未必能做出准确的筛查,如父母均为轻型地中海贫血,即有可能生出中间型或重型地中海贫血患儿.这部分患儿常常需要规律输血及除铁,这些均为治标手段
18、,且存在较多不良反应,对于我国及发展中国家的患者和政府公共卫生支出也是巨大的负担 .目前我国每年仍有相当数量的地中海贫血患儿不断降生,而现存的很多地中海贫血患儿也尚未能得到很有效的治疗,这既是当今医学的难题,也成为重要的社会问题.对于珠蛋白基因缺陷的地中海贫血而言,诱导珠蛋白表达以代偿珠蛋白功能是其重要的新型治疗手段,但目前各种诱导西药均有免疫抑制等明显副作用 .我们既往发现健脾补气生血的中药黄芪、党参及补肾益精生血的中药龟板等可激活人类红系细胞株珠蛋白基因的表达.随后的临床研究显示上述中药组成的补气益精生血方药对儿童地中海贫血有良好疗效且副作用小,能有效诱导患儿珠蛋白基因的表达、合成胎儿血红
19、蛋白而发挥代偿正常血红蛋白的作用 ,其诱导机制与激活p 丝裂原活化的蛋白激酶(m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e,MA P K)信号通路 等有关.我们的前期体外研究还提示中药可通过p MA P K通路增强珠蛋白基因启动子区组蛋白磷酸化乙酰化修饰,使相关区域染色质结构松散而基因易于转录.至于中药是否通过影响组蛋白酶从而提高修饰水平,目前尚未明了.本研究在既往基础上继续深入,观察本课题中药能否影响人红系细胞组蛋白修饰酶相关指标,包括组蛋白 脱乙酰基酶(h i s t o n ed e a c e t y l a s e,HD
20、 A C)中的H D A C、H D A C,组蛋白乙酰基转移酶(h i s t o n e a c e t y l t r a n s f e r a s e,HA T),以期进一步从表观遗传角度揭示中药治疗地中海贫血的分子机制.材料与方法 材料 细胞株目前永生化的人红系细胞K 为研究珠蛋白基因表达及胎儿血红蛋白诱导的常用工具,本研究选用K 细胞株作为研究对象,由广州致邦生 物 科 技 有 限 公 司 提 供 赛 库 生 物(C e l l C o o k),货号C C .药物黄芪、龟板、党参 水提物(补气益精生血中药),黄芪、党参 水提物(补气生血中药)以及龟板水提物(益精生血中药)分别按
21、 g/L及 g/L的浓度委托广州中医药大学中西医结合基础研究中心以水提法进行制备.丁酸钠(S i g m a公司).试剂T r i z o l试剂(T h e r m oF i s h e r公司);胎牛血清、R PM I中性 培养基(G I B C O公司);P r i m e S c r i p tTMR Tr e a g e n tK i tw i t hg D NA E r a s e r逆转录试剂盒、T BG r e e nP r e m i xE xT a q荧光定量P C R试 剂 盒(T a K a R a公 司);E p i Q u i kTMm AR NA M e t h
22、y l a t i o nQ u a n t i f i c a t i o nK i t试剂盒(E P I G E NT E K公司);R I P A裂解液、聚丙烯酰胺凝胶(碧云天公司);二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(美仑生物公司);I g G二抗、HD A C 一抗,HD A C 一抗、HAT一抗(A b c a m公司);超敏化学发光试剂盒(M i l l i p o r e公司).仪器匀浆机(I KA公司);冰箱(N B S公司);高速低温离心机(科大创新公司);微量移液器(G I L S ON公司);全自动实时荧光定量P C R仪(B I O R A D公司);酶标仪(P e r k i
23、 n E l m e r公司);蛋白电泳仪(B I O R A D公司);显影仪成像分析系统(UV P公司).研究方法 分组及加药K 细胞株取等份,根据我们前期浓度梯度及时间梯度预实验得出的高、低诱导浓度与最佳诱导时间,按以下组分别加药:()以 g/L黄芪、龟板、党参水提物诱导 h的为补气益精低剂量组;()以 g/L黄芪、龟板、党参水提物诱导 h的为补气益精高剂量组;()以 g/L黄芪、党参水提物诱导 h的为补气低剂量组;()以 g/L黄芪、党参水提物诱导 h的为补气高剂量组;中国中西医结合儿科学 年 月第 卷第期C h i nP e d i a t r I n t e g rT r a d
24、i tW e s tM e d,O c t ,V o l ,N o ()以 g/L龟板水提物诱导 h的为益精低剂量组;()以 g/L龟板水提物诱导 h的为益精高剂量组;()以 m o l/L丁酸钠诱导 h的为阳性对照组(丁酸钠组);()未加药处理的为空白对照组.珠蛋白基因表达水平检测诱导结束后收集各组细胞.从G e n b a n k查得珠蛋白基因序列,设 计 引 物 如 下:F o r w a r d:G G C AA C C T GT C C T C T G C C T C ,R e v e r s e:GAA AT GGATT G CC AAAA CG G .以T r i z o l裂解
25、K 细胞,加氯仿抽提总R NA,利用P r i m e S c r i p tR T逆转录酶逆转录合成c D NA,以c D NA为模板,实时P C R扩增基因核酸.采用T BG r e e n作为荧光素分子标志,实时读取荧光强度并自动描出各样本扩增曲线.根 据C t值、标 准 曲 线 以 及 以 内 参 基 因GA P DH核酸量矫正,算出每个样本基因的核酸拷贝数.实验重复次.HD A C、HD A C、HAT活性检测提取细胞总R NA.制备缓冲液、抗体溶液、增强剂溶液及阳性对照品,制备标准曲线.按照说明书添加稀释液体、培养及进行酶反应.反应终止后在 n m处读取吸光度.用专门公式计算m A
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 补气 益精生血 中药 人红系 细胞 组蛋白 修饰 影响
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【自信****多点】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【自信****多点】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。