T-2毒素神经毒性作用机制研究.pdf
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1、 18 天 津 科 技第 50 卷 增刊第 50 卷 增刊2023 年 11 月Vol.50 Suppl.Nov.2023天 津 科 技 TIANJIN SCIENCE&TECHNOLOGY0 引 言对哺乳动物有毒的 300 多种真菌中,镰刀菌是最常见的大规模产毒真菌之一,其严重破坏农作物生产。镰刀菌毒素的次生代谢物通常存在于谷物食品、动物饲料和其他动物副产品中,易引发食品污染和哺乳动物中毒,威胁人类健康1。T-2 毒素作为一种核毒素,已成为镰刀菌产生的 20 多种真菌毒素中最重要的成员之一。T-2 毒素可被人或动物的皮肤、黏膜、胃肠道等部位吸收,从而阻碍肝脏、肾脏、免疫、生殖、消化系统和血液
2、循环系统的正常功能,最终引起整个组织的毒性反应2。据估计,全球每年有 25%的作物受到真菌毒素感染3,T-2 毒素在人类周围环境中惊人的污染率也被众多报道所证明4-6。中枢神经系统(central nervous system,CNS)作为人体最重要的防线,调控着人体和动物的生命活动。已有研究报道关于真菌毒素介导除大脑以外的组织和器官毒性7。然而近年来对真菌毒素的神经毒性研究越来越多,有 基础研究T-2 毒素神经毒性作用机制研究李道稳1,2,刘 芳1,李 源1,胡鹏程1,刘鼎阔1*(1.天津市生物饲料添加剂企业重点实验室,鼎正新兴生物技术(天津)有限公司 天津 300383;2.天津农学院动物
3、科学与动物医学学院 天津 300384)摘 要:T-2 毒素是一种具有神经毒性的霉菌毒素,主要污染农作物及其制品,已经发现PC12 细胞对低于 12 ng/mL的T-2 毒素很敏感,表现为细胞活力下降、乳酸脱氢酶(LDH)释放增加并伴有氧化应激和线粒体损伤、Nrf2/HO-1通路上调、线粒体膜电位(MMP)降低和线粒体凋亡。通过研究,首次发现T-2 毒素可引发神经炎症,表现为NF-B的表达和易位增加,以及提高促炎细胞因子TNF-、IL-6、IL-8 和IL-1的分泌。综上所述,T-2 毒素刺激PC12细胞诱发细胞凋亡和炎症,而氧化应激在神经毒性过程中起关键作用。关键词:T-2 毒素 神经毒性
4、神经炎症 氧化应激 细胞凋亡中图分类号:S859.83 文献标志码:A 文章编号:1006-8945(2023)增-0018-06Study on Molecular Mechanism of T-2 Toxin-induced Neurotoxicity LI Daowen1,2,LIU Fang1,LI Yuan1,HU Pengcheng1,LIU Dingkuo1*(1.Tianjin Key Laboratory of Biological Feed Additive Enterprise,S&E Burgeoning Biotechnology Co.,Ltd.,Tianjin 3
5、00383,China;2.College of Animal Science and Veterinary Medicine,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China)Abstract:T-2 toxin is a neurotoxic mycotoxin,which mainly pollutes crops and their products.PC12 cells have been found to sensitive to T-2 toxins lower than 12 ng/mL,which was manifes
6、ted as decreased cell viability,increased lactate dehydrogenase(LDH)release accompanied by oxidative stress and mitochondrial damage,and up-regulated Nrf2/HO-1 pathway,inducing decreased mitochondrial membrane potential(MMP)and mitochondrial apoptosis.For the first time,it was found that T-2 toxins
7、could trigger neuroinflammation,manifested as increased expression and translocation of NF-B and increased secretion of pro-inflammatory cytokines TNF-,IL-6,IL-8 and IL-1.In summary,T-2 toxins stimulate PC12 cells to induce apoptosis and inflammation,while oxidative stress plays a key role in the ne
8、urotoxic process.Key words:T-2 toxin;neurotoxicity;neuroinflammation;oxidative stress;apoptosis*通讯作者基金项目:国家自然科学基金“基于SIRT1-TFEB轴调控自噬细胞焦亡通路探讨芍药苷靶向干预氧化锌纳米颗粒肝毒性的作用机制”(32302926);中国博士后科学基金“基于数字化分析的饲料霉菌毒素快速检测及生物脱霉剂开发与应用研究”(2021M700708)。收稿日期:2023-09-21 19 2023 年 11 月研究表明,一些无法治愈的神经系统疾病可能与真菌毒素有关,如抑郁症、自闭症、阿尔茨海
9、默病和帕金森病8-11。还有研究表明,低浓度T-2 毒素可破坏血脑屏障(BBB),表现为紧密连接蛋白occludin表达降低和血脑屏障通透性改变12。本研究揭示了T-2 毒素诱导神经元氧化应激、凋亡和炎症的分子机制,这一新发现为实时监测食品污染和预防微量T-2 毒素介导的神经炎症提供了参考。1 材料与方法1.1 化学试剂T-2 毒素(CAS NO.21259-20-1)来自Sigma(St.Louis,MO,USA)。二甲基亚砜(DMSO)和细胞计数试 剂 盒-8(CCK-8)购 自AMRESCO Inc.(Solon,OH,USA)。2,7 -二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、JC-1(
10、线粒体膜电位探针)和Hoechst 33342(荧光dna结合染料)购自Solarbio生命科学公司(北京)。1.2 细胞培养本实验以PC12 细胞作为神经元模型细胞,采用46 cm培养瓶对含有 10%(V/V)FBS的RPMI 1640进行细胞培养。在培养液中加入 100 g/mL链霉素和 100 U/mL青霉素。细胞保存在 37、5%CO2气氛的湿润培养箱中。1.3 细胞活力和乳酸脱氢酶(LDH)释放检测采用CCK-8 检测试剂盒检测细胞活力,每孔用100 L RPMI 1640 加 10%CCK-8 试剂处理 1 h,然后用Thermo Scientific的分光光度板仪在 450 nm
11、处读取光密度(OD)。T-2 毒素浓度梯度分别为 0.75、1.5、3、6、12 ng/mL,光镜下观察细胞形态。为了检测LDH,收集上清液,然后使用检测试剂盒评估LDH活性。1.4 细胞内活性氧(ROS)和氧化应激标志物水平的测定DCFH-DA可作为荧光探针来估测细胞ROS水平。细胞处理后,用 10 M DCFH-DA预孵育细胞,并在 37 的避光环境中保持。处理 20 min后,通过荧光显微镜在 530 nm处测量DCF氧化引起的荧光强度增加来分析细胞ROS水平。为了评估氧化应激标志物的变化,使用检测试剂盒检测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽(GS
12、H)含量。1.5 线粒体膜电位测定用JC-1 探针测定MMP的变化。细胞处理后加入 0.5%JC-1 染料。30 min后,用PBS轻轻冲洗每孔,在超分辨率荧光显微镜下通过区分荧光颜色来检测MMP,最后通过Image J软件分析和描述JC-1 染色细胞的荧光强度。1.6 Hoechst 33342 染色法选用Hoechst 33342 溶液作为荧光DNA结合染料,评估细胞凋亡程度。细胞处理后,每孔在避光条件下用 0.1%Hoechst 33342 处理 30 min,然后在超分辨率荧光显微镜下观察染色细胞的特征形态。1.7 蛋白提取和蛋白质免疫印迹用刮板收集PC12 细胞,在裂解缓冲液中匀浆,
13、通过超声波细胞分离,然后在4 下离心10 min(12 000 rpm)收集上清液。使用BCA试剂盒检测蛋白浓度,最后用蛋白质免疫印记的方法检测蛋白含量,在Image lab计算蛋白表达量进行比较分析。1.8 细胞因子检测收集各处理PC12细胞的培养上清,使用Luminex液相细胞因子芯片检测IL-1、IL-6、TNF-和IL-8 水平。1.9 NF-B易位的免疫荧光检测采用免疫荧光染色法观察神经毒性过程中NF-B的活化和易位。细胞处理后,在室温下用 4%多聚甲醛固定 20 min。PBS洗涤 2 次后,用TritonX-100(1%)穿孔。处理 20 min后,将细胞在含 5%BSA的PBS
14、培养皿(37)中阻断 2 h。将PC12 细胞与抗NF-B抗体反应 24 h,在 4 环境中保存。再次洗涤后,FITC-IgG标记二抗参与反应 2 h,然后用PBS洗涤,最后加入 DAPI 荧光染料。3 min 后,使用触摸屏荧光显微镜在 488 nm处检测NF-B活性和易位并拍照。1.10 统计分析实验组和对照组的统计数据应用GraphPad Prism 8 for Windows软件(GraphPad,La Jolla,California)。数据分析采用单因素方差分析(ANOVA),然后再进行Tukey多重比较检验或独立样本t检验。所有实验结果均以均数标准差(SD)的形式显示,重复 3
15、次。标准参考p值 0.05 认为有统计学意义。2 结果与分析2.1 T-2 毒素对PC12 细胞的细胞毒性PC12 细胞经T-2 毒素处理 24 h后,表现为细胞活力下降,LDH水平呈剂量依赖式升高(图 1)。在 112 ng/mL T-2 毒素处理 24 h后,代表细胞活性的OD值显著下降至 71.3%、57.0%、44.7%、42.6%、37.4%、34.0%、33.2%和 31.7%(p 均 0.01)(图 1A);李道稳等:T-2 毒素神经毒性作用机制研究 20 天 津 科 技第 50 卷 增刊使用浓度 3 ng/mL的T-2 毒素处理PC12 细胞 24 h后,细胞染色质发生浓缩,出
16、现凋亡小体(图 3B)。与对照组相比,细胞凋亡率分别升高至 7.67%、16.3%、26.1%、40.2%和 41.9%(图 3D)。2.4 T-2 毒素对凋亡相关蛋白表达的影响为了确认T-2 毒素引起PC12 细胞凋亡途径,使用western blot检测凋亡相关蛋白的水平(图 4A)。T-2 毒素浓度6 ng/mL时,Bcl-2 蛋白表达显著下降(图 4C);浓度 1.5 ng/mL时,Bax表达显著增加(图 4B)。此外,Cyt-c的表达随T-2毒素浓度(0.75、1.5、3、6、12 ng/mL)升高而增加(图 4D)。当T-2 毒素浓度 1.5 ng/mL时,细胞中裂解型caspas
17、e-3 和裂解型caspase-9 表达显著增加(图 4E和 4F)。LDH释放率从 25.7%显著增加到 77.9%(p均 0.01)(图 1B)。结果表明,PC12 细胞神经元的标志物NeuN蛋白在不同浓度的T-2毒素(0、0.75、1.5、3、6、12 ng/mL)处理 24 h后的表达随着T-2 毒素浓度增加而减少,细胞的排列也比对照组更加松散,梭形细胞的比例明显减少(图 1C)。这些结果均表明,微量T-2 毒素对PC12 细胞有毒性。图 1 T-2 毒素对PC12 细胞的细胞毒性Fig.1 Cytotoxicity of T-2 toxin on PC12 cells(A)采用CCK
18、-8 法测定不同浓度T-2 毒素处理 24 h后pc12 细胞的细胞活力,对照细胞活力设为 1;(B)T-2 毒素处理 24 h后,测定LDH渗漏水平;(C)不同浓度T-2 毒素(200 )处理 24 h后,测定神经元标志物NeuN蛋白的表达。2.2 T-2 毒素对活性氧生成及氧化应激相关指标的影响为了验证T-2 毒素在 0.75、1.5、3、6 和 12 ng/mL不同浓度下引起的氧化应激损伤,荧光探针DCFH-DA显示PC12 细胞中ROS产量增加(图 2A)。与对照组相比,T-2 毒素处理细胞的ROS生成水平呈剂量依赖式增加,分别达到对照组的 1.03、1.41、1.97、2.48和 2
19、.65 倍(P 0.05 或P 0.01)(图 2B)。MDA最终增加至 5 nmol/mg以上,12 ng/mL组SOD、CAT和GSH水平均显著低于 70%(图2C F)。如图 2G所示,T-2 毒素 6 ng/mL时,Nrf2 和HO-1 的表达在 24 h内显著升高并达到最高水平,而当T-2 毒素浓度 6 ng/mL时,Nrf2 和HO-1 的表达逐渐被抑制。2.3 T-2 毒素促进线粒体功能障碍和细胞凋亡采用JC-1 染色法检测T-2 毒素对线粒体完整性的影响。PC12 在浓度分别为 0.75、1.5、3、6、12 ng/mL的T-2 毒素预处理 24 h后与对照组相比,MMP明显减
20、少,荧光颜色出现变化(图 3A),MMP的定量结果也明显减少(图 3C)。凋亡细胞出现核固缩、核断裂,图 2 T-2 毒素对活性氧生成及氧化应激相关指标的影响Fig.2 Effects of T-2 toxin on production of reactive oxygenspecies and related indexes of oxidative stress(A)T-2 毒素处理PC12 细胞 24 h,10 M DCFH-DA孵育 20 min,荧光显微镜(100 )下观察细胞荧光强度;(B)采用 Image j软件对ROS生成的定量进行分析;(C)(F)使用特异性试剂盒对T-2
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